乳腺癌肿瘤微环境中HMGB1蛋白及HMGB1/TLR4信号通路的水平

梁 曦 张成华 房明丽 王书君 王 澍 赵海东 张 乐

(大连医科大学附属第二医院乳腺外科，辽宁 大连 116021)

高迁移率族蛋白(HMGB)1是一种广泛存在于真核细胞内的非组蛋白〔1〕，正常情况下作为一种DNA结合蛋白调节着多种基因的转录与表达〔2〕。当机体感染病毒时，HMGB1可由激活的免疫细胞(包括单核/巨噬细胞、树突细胞(DC)等〕主动分泌，或由坏死的细胞被动释放〔3,4〕，释放到细胞外的HMGB1作为一种炎症因子与细胞膜上的受体〔如Toll样受体(TLR)4,糖基化终末产物(RAGE)〕结合诱导机体发生炎症反应〔5,6〕。研究显示，HMGB1在乳腺癌组织的表达明显升高〔7〕。肿瘤组织细胞质中HMGB1水平越高，组织中浸润的淋巴细胞越多〔8〕。肿瘤细胞释放的HMGB1可抑制传统的杀伤性T细胞从而促进肿瘤生长。除此之外，释放到细胞外的HMGB1还可以与免疫调节性T细胞(Treg)表面的TLR4和RAGE配体结合，进而激活Treg细胞并释放白细胞介素(IL)-10等细胞因子促进肿瘤细胞免疫逃逸,进而促进肿瘤生长〔9〕。另有相反的研究显示：放疗或抗肿瘤治疗杀伤的肿瘤细胞释放的HMGB1，可以与成熟DC细胞表面的TLR2或TLR4手提结合激活天然免疫，进而发挥抗肿瘤的免疫功能〔10,11〕。本研究主要探讨不同临床分期乳腺癌组织细胞质中HMGB1及其信号通路HMGB1/TLR4的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1临床资料 选择大连医科大学附属第二医院2015年9～12月行乳腺癌根治术的手术标本52例，均为女性，年龄55～65岁,均经病理确诊。淋巴结转移22例，远端转移17例，无转移13例；按国际抗癌联盟(UICC)-TNM标准临床分期,Ⅰ期13例,Ⅱ期22例,Ⅲ+Ⅳ17例;组织病理分级为低分化16例、中分化22例、高分化14例;另取癌旁组织10例作为正常对照。

1.2实验材料 HMGB1单克隆抗体(货号ab18256,abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号：60004-1 Proteintech公司)；逆转录试剂盒(货号AE301,TransGen Biotech公司);荧光定量PCR试剂盒(货号：AQ131；TransGen Biotech公司)；羊抗兔二抗-辣根过氧化物酶(HRP)二抗(货号ab6721,abcam公司)；NE-PER 核浆分离试剂盒(货号78833，Termo Scientific)；电化学发光(ECL)Western印迹试剂盒 (美国Pierce公司)。

1.3组织总RNA提取及定量PCR检测 手术时切除不同临床分期肿瘤组织或癌旁组织作为检测标本，分别取检测组织约100 mg放到1 ml的Trizol试剂中，根据说明书提取总RNA后逆转录成cDNA,采用qRT-PCR方法测定HMGB1、RAGE、TLR4的表达，以GAPDH作为内参。25 μl反应体系，扩增条件为：94℃预变性4 min，94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s。 35个循环。根据各目的基因的CT值，用2-ΔΔCt法〔12〕比较Ct值，计算肿瘤组织组HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA相对于癌旁组织的表达量。

1.4引物的设计和合成 根据美国国立生物技术信息中心Genebank数据库，搜索人HMGB1、RAGE、TLR4和GAPDH的cDNA序列。设计引物：HMGB1正义链：5′-GCATGGGCAAAGGAGATCCTAA-3′，反义链：5′-TTAGCAGACATGGTCTTCCAC-3′；RAGE正义链：5′-GCTCTTCACACTGCAGTCGG-3′，反义链：5′-GAGCTACTGCTCCACCTTCT-3′；TLR4正义链：5′-GGTCAGACGGTGATAGCGAG-3′，反义链：5′-GGATTTCACACCTCCACGCA-3′；GAPDH正义链：5′-AATGACCCCTTCATTGAC-3′，反义链：5′-TCCACGACGTACTCAGCGC-3′。设计的引物由上海生物工程合成。

1.5Western印迹检测肿瘤组织细胞质内HMGB1蛋白水平 NE-PER 核质分离试剂盒裂解液提取不同临床分期肿瘤组织或癌旁组织中细胞质中的总蛋白(参照说明书)。将提取的蛋白质进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),蛋白质样品每泳道上样量均为100 μg,电泳后进行聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜,BSA室温封闭2 h,1∶1 000稀释HMGB1抗体,4℃过夜孵育，洗膜，HRP标记的羊抗兔抗体(1∶5 000)室温孵育2 h，洗膜，ECL法显色，照相。用计算机图像分析系统扫描条带的灰度值，然后计算每个标本中HMGB1蛋白的相对表达量(HMGB1/GAPDH比值)。

1.6统计学分析 应用SPSS16.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1不同临床分期乳腺癌组织细胞质中HMGB1蛋白的表达 Ⅰ期(1.09±0.18)与Ⅱ期(0.93±0.12)乳腺癌组织细胞质中的HMGB1蛋白明显高于癌旁组织(0.57±0.05,P<0.05)。而与癌旁组织相比，Ⅲ+Ⅳ期(0.65±0.11)乳腺癌组织细胞质中的HMGB1蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

1：癌旁组织；2：Ⅰ期乳腺癌组织；3：Ⅱ期乳腺癌组织；4：Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌组织图1 乳腺癌组织和癌旁组织HMGB1的表达

2.2乳腺癌组织与癌旁组织中HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平比较 癌旁组织HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平分别为：1.13±0.16、1.00±0.18、1.06±0.12；乳腺癌组织分别为：1.63±0.25、1.66±0.24、1.52±0.20。与癌旁组织相比，乳腺癌组织中HMGB1和RAGE的mRNA水平均明显增高(均P<0.01)。

2.3不同临床分期乳腺癌组织中HMGB1、RAGE、TLR4 mRNA水平比较 Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌组织中HMGB1 mRNA水平分别为：1.48±0.11、1.69±0.30、1.72±0.26；RAGE mRNA水平分别为：1.57±0.12、1.71±0.31、1.68±0.21；TLR4 mRNA水平分别为：1.52±0.15、1.53±0.22、1.50±0.23。Ⅱ期乳腺癌及Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌组织中HMGB1 mRNA水平明显高于Ⅰ期(均P<0.05)。HMGB1的表达水平与肿瘤的分期具有相关性。 但Ⅱ期和Ⅲ+Ⅳ期乳腺癌组织中的RAGE和TLR4 mRNA水平与Ⅰ期相比差异无统计学意义(均P>0.05)。

3 讨 论

HMGB1 广泛表达于多种组织细胞，具有调节基因转录、稳固细胞核结构的功能，同时也是一种重要的损伤相关的分子识别模式(DAMPs)〔13〕。细胞核内的HMGB1蛋白可由细胞核迁移到细胞质，并释放到细胞外〔14〕。免疫细胞主动分泌或坏死细胞被动释放到细胞外的HMGB1通过与其配体 RAGE或TLR2、TLR4和TLR9结合发挥免疫应答调节作用〔15〕,也参与肿瘤的发生、发展〔7〕。HMGB1蛋白在肿瘤发生过程中具有双重的作用。HMGB1通过RAGE蛋白促进肿瘤组织中血管的生成〔16〕，进而促进肿瘤的发生。如果抑制HMGB1-RAGE的相互作用可以通过抑制核转录因子(NF)-κB信号通路进而抑制肿瘤的生长和转移。研究显示，HMGB1蛋白具有抗肿瘤的作用。肿瘤细胞胞质内高水平的HMGB1蛋白能够促进DC细胞和淋巴细胞浸润到肿瘤组织中发挥抗肿瘤作用〔17〕。本研究结果说明乳腺癌早期HMGB1蛋白位于细胞质中，中晚期乳腺癌细胞中HMGB1蛋白以分泌到细胞外。同时，本研究发现肿瘤组织中RAGE和TLR4的的mRNA水平远远高于正常组织。说明中晚期乳腺癌组织分泌到细胞外的HMGB1蛋白通过其配体RAGE和TLR4相合促进了肿瘤的发生、发展，与Taguchi等〔18〕研究结果相类似，他们发现坏死的肿瘤细胞释放的HMGB1与其配体RAGE结合后激活HMGB1-RAGE信号通路促进肿瘤的浸润与转移。综上，乳腺癌组织细胞质中HMGB1蛋白水平与乳腺癌的进展密切相关，该蛋白可能发展成为判断乳腺癌预后的一个临床标志。