手性杀菌剂苯醚甲环唑在火龙果中的残留消解行为研究

张利强 邢淑莲 林丽云 林玲 杨春亮

摘要 建立了火龙果中手性苯醚甲环唑分离并测定的固相萃取一高效液相色谱法，并比较分析不同处理浓度下苯醚甲环唑对映体在火龙果中的消解动态和立体选择性。研究表明：苯醚甲环唑4个对映体的消解动态均符合一级动力学方程，低、高浓度处理组半衰期分别为1.78～2.34d和1.70～2.72d。EF_A在2个处理下均表现为前期大于0.5且逐渐升高，后期逐渐降低至0.4左右;EF_B在低浓度处理时整个采样时期从0.55一直降低至0.43，而高浓度处理时，则先升高至0.6后逐渐降低至0.4左右。结果证明，苯醚甲环唑2对对映体在火龙果体内降解很快，存在立体选择性降解行为，并且处理浓度不同，选择性降解情况也不尽一致。

关键词 手性农药;苯醚甲环唑;火龙果;农药残留;消解动态

中图分类号 S667 .9 文献标识码 A

手性（chiral）是自然界物质的基本属性之一。对映体之间除偏振光作用外，其他物理化学性质几乎相同，但在与手性的生命系统作用时常表现出明显的差异[1]。近年来，手性农药因具有靶点明确、药效快、杀灭率高等特点，应用越来越广泛。研究表明，手性农药对映体生物活性和毒性通常差别较大，且进入生态环境后，在动植物体内的降解、代谢及转化也往往不同[2-3]。因此，开展手性农药对映体选择性行为研究，将为手性农药的环境安全评价，乃至保障食品安全都具有重要研究意义。

火龙果又名红龙果、仙蜜果、情人果等，属仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）和蛇鞭柱属（Selenicereus）植物[4]，具有很高的食疗价值和经济效益，已成为近年来各热区农业新、特、优、高重点开发项目之一。然而由于其种植环境多为高温高湿地区，加上种植面积逐年扩大，导致连片地块病害发生呈加重趋势[5]。苯醚甲环唑作为三唑类手性杀菌剂代表品种，因具有广谱性、持药期长、药效高，兼具保护、治疗和内吸性等优点，已成为包括火龙果在内蔬菜水果生产中使用最广泛、用量最大的杀菌剂之一[6]。由于其分子结构中含有2个手性中心，4个对映异构体，在不同植物体内降解、代谢和转化等环境行为较为复杂，因此在对映体水平上开展火龙果中苯醚甲环唑选择性环境行为研究十分必要。

目前，苯醚甲环唑在蔬菜[7-10]、水果[11-17]中的残留与降解动态研究已有大量文献报道，然而研究对象基本仍是外消旋形式，虽然近几年在手性对映体水平取得了不同程度的进展，但在热带水果选择性环境行为研究方面尚属空白。因此，本文以火龙果为代表，在建立的手性拆分苯醚甲环唑对映体基础上，模拟田间喷药实验，研究了其在火龙果中的立体选择性行为规律，以期为苯醚甲环唑在热带水果中的风险评估提供技术支撑和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

岛津LC-20AD高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器、自动进样器（日本岛津公司）;PL-602L电子天平（美国梅特勒-托利多公司）;24N-EVAP112型氮吹仪（美国ORGANOMATION公司）;MS-3振荡器（德国IKA公司）;立式大容量高速离心机（日本日立公司）。外消旋体苯醚甲环唑微乳剂（10%有效成分，中国农业科学院植保所廊坊中试厂）;外消旋体苯醚甲环唑标准品（纯度≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）;正己烷、丙酮、乙腈、乙醇（色谱纯，德国默克公司）;氯化钠（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）;其他试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

供试对象为2012年生红心火龙果（品种为大红）。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

供试火龙果在湛江市湖光农场试验基地进行，生长及水肥管理均有该基地负责实施，保证供试火龙果的正常生长发育、开花结实。

试验设置了3个处理组，空白对照组（喷水处理）、低浓度处理组（10%苯醚甲环唑微乳剂的推荐用量，150ga.i.ha-1）、高濃度处理组（10%苯醚甲环唑微乳剂推荐用量的1.5倍，225g a.i.ha-1），每个处理组设3个平行小区，每个小区火龙果不少于5株。在火龙果坐果期施药1次，分别于施药后2h、1d、2d、4d、6d、8d、15d、30d采集样品，每次每个处理组随机采样15个（每个小区采集5个）全部样品分别密封于对应编号塑料袋中，迅速运回实验室后搅碎混匀，分装后于-20℃冰箱中贮存待测。

1.2.2 项目测定

1.2.2.1 样品前处理

将采集的火龙果样品，带皮切成小片，用打碎机磨成果浆。称取试样10.00g于50mL离心管中，加入20.0mL乙腈于上述离心管中，混匀，加入4.0g氯化钠，涡旋1min，再高速离心5min，之后吸取上清液氮吹至约1mL。用4.0mL乙腈-甲苯（3：1，V/V）预先淋洗石墨化炭黑/氨基小柱，等到液面近干时，把提取液加入到小柱中，再向浓缩管中加入2.0mL乙腈-甲苯（3：1，V/V），涡旋后一并加入到小柱。然后用10.0mL上述混合溶剂洗脱，洗脱液氮吹干，用正己烷定容至1.0mL，过0.22μm有机滤膜后待测。

1.2.2.2 色谱条件

手性色谱柱：Chiralcel IF-3（4.6mm×250mm，3μm），填料为直链淀粉-三（3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯）共价键合3μm硅胶，购于日本大赛璐化学工业公司。流动相为正己烷-乙醇（92：8，V/V），使用前手动摇匀。流速为1.0mL/min，检测波长为220nm，进样量为60μL。

1.2.3 数据处理

1.2.3.1 降解动力学分析

苯醚甲环唑的对映体在火龙果中的降解曲线用指数回归方程来拟合，相应的降解速率常数根据以下公式来计算：

C_T==C₀e^-KT

式中：G_T为时间为T时目标化合物的残留量，单位为mg/kg;C₀为施药后的原始沉积量，单位为mg/kg;K为消解系數;T为施药后时间，单位为d。

其半衰期（T_1/2）计算公式如下：

T_1/2=ln2/K=0.693/K

1.2.3.2 对映体环境选择性分析

苯醚甲环唑有两对对映体，苯醚甲环唑A（2R，4R与2S，4S）和苯醚甲环唑B（2R，4S与2S，4R），分别采用EF_A和EF_B作为两对对映体之间的选择性变化指标。

（2R，4R）-苯醚甲环唑

（2R，4R）-苯醚甲环唑+（2S，4S）-苯醚甲环唑

（2R，4S）-苯醚甲环唑

（2R，4S ）-苯醚甲环唑+（2S，4R）-笨醚甲环唑

EF值一般在0～1.0，当EF=0.5时表明两对映体之间没有选择性差异，当EF值偏离初始EF值越远，表明两对映体之间的立体选择性降解差异越明显。

2 结果与分析

2.1 分析方法的验证

以峰面积（y）为纵坐标，苯醚甲环唑对映体的质量浓度（mg/L）为横坐标建立基质匹配标准曲线，结果表明：单个对映体在0.10～40mg/L范围内呈良好的线性关系。4个对映体回归方程分别为：（2R，4R）-苯醚甲环唑y₁=1707.4x1+246.8，r₁=0.9995;（2S，4S）-苯醚甲环y₂=1592.2x₂+227.0，r₂=0.9996;（2R，4S）-苯醚甲环y₃=2329.5x₃+565.7，r₃=0.9988;（2S，4R）-苯醚甲环唑y₄=1893.7x₄+384.8，r₄=0.9994。按3倍于噪音信号推算得到单个对映体的检出限为0.02mg/L。

当外消旋苯醚甲环唑加标水平为0.4和4.0mg/kg时，苯醚甲环唑4个对映体的平均回收率为87.4%～93.0%，RSD为2.9%～4.6%（表1），满足农药残留分析试验的要求。

2.2 苯醚甲环唑对映体在火龙果中的消解动态

消解动态试验结果（图2）表明：施药后当天（2h），低、高浓度两处理组火龙果果实中苯醚甲环唑对映体原始沉积量分别为5.78、5.81、6.48、6.57mg/kg与9.54、9.50、10.34、10.49mg/kg，高浓度处理组显著高于低浓度处理组。两处理组样品均在喷药后迅速降解，到8d时苯醚甲环唑4个对映体降解率就超过95%，到15d时降解率均超过98%，到第30天时均无苯醚甲环唑检出。

两处理组苯醚甲环唑对映体残留量变化趋势均符合一级动力学方程（表2），其中低浓度处理组半衰期为1.78～2.34d，高浓度处理组半衰期为1.70～2.72d，表明苯醚甲环唑在火龙果中属于易降解农药，半衰期受喷施浓度影响不大。

2.3 手性苯醚甲环唑在火龙果中的立体选择性

从EF值变化趋势（图3）得出，EF_A与EF_B在2h到15d时间内均处于0.4～0.6，表明苯醚甲环唑在火龙果内存在一定程度的立体选择性降解行为，并且随着施药时间延长而发生变化。其中EF_A在2个处理下均表现为前期大于0.5且逐渐升高，后期逐渐降低至0.4左右;EF，在低浓度处理时整个采样时期90.55一直降低至0.43，而高浓度处理时则先升高至0.6之后逐渐降低至0.4左右。

结合4个对映体半衰期分析，（2S，4S）-苯醚甲环唑>（2R，4R）-苯醚甲环唑，（2S，4R）-苯醚甲环唑>（2R，4S）-苯醚甲环唑，说明在2个浓度处理下苯醚甲环唑A两个对映体在施药后前期存在不明显的选择性降解，但随着施药时间延长，选择性降解趋势发生改变并且逐渐显现，（2R，4R）-苯醚甲环唑降解速度相对变快，导致（2S，4S）-苯醚甲环唑在后期果实内逐渐积累;而苯醚甲环唑B在低浓度处理时（2R，4S）-苯醚甲环唑优先被降解，在高浓度处理前期（2S，4R）-苯醚甲环唑优先被降解，之后选择性降解趋势发生改变，到后期时（2R，4S）-苯醚甲环唑则降解速度相对变快，导致（2S，4R）-苯醚甲环唑在后期果实内逐渐积累。

3 讨论与结论

本研究结果显示，苯醚甲环唑4个对映体在火龙果中降解均较快，半衰期很短（<3.0d），到第8天时，苯醚甲环唑4个对映体降解率就超过95%，这与陈树兵等[9]在小松菜、王绍敏等[10]在黄瓜、王素琴等[14]在石榴、周松等[16]在草莓中的研究结果基本一致（<4.0d），说明苯醚甲环唑在田间使用中属于易降解农药。但半衰期要短于刘艳萍等[17]在香蕉中（7.9～12.9d）、高川等[12]在葡萄中（5.6～16.4d）的研究结果。原因可能是每种植物体内的环境或者代谢酶活性不同，而且已有研究表明温度、光照强度、降雨量等气候条件对苯醚甲环唑降解也会产生影响。就本研究对象火龙果而言，具体原因还需要深入研究验证。

本研究实验还证明，在火龙果体内苯醚甲环唑存在一定程度的立体选择性降解行为，并且处理浓度不同选择性降解情况也不尽一致，但随着施药时间延长苯醚甲环唑A和苯醚甲环唑B降解趋势逐渐归于一致，导致（2S，4S）-苯醚甲环唑海（2S，4R）-苯醚甲环唑在后期果实内逐渐积累，这与贺敏[18]在水稻植株内的研究结果EF_A和EF_B均小于0.5，李晶[19]在番茄中的研究结果（2S，4S）-苯醚甲环唑和（2S，4R）-苯醚甲环唑最终在番茄果实富集均一致。然而，本研究发现的不同浓度处理时选择性降解趋势发生改变的原因还需进一步研究。

本研究建立了对火龙果中手性苯醚甲环唑分离并测定的固相萃取一高效液相色谱法，并比较分析不同处理浓度下苯醚甲环唑对映体在火龙果中的消解动态和立体选择性，发现苯醚甲环唑4个对映体在火龙果中降解符合一级动力学，并存在一定程度的立体选择性降解行为。

参考文献

[1]唐梦龄，王丹，傅柳松，等.手性农药毒性机制的对映体选择性[J].农药学学报，2011，13（4）：35-340.

[2]Garrison A W.Probing the enantioselectivity of chiralpesticides[J].Environmental Science andTechnology，2006，40（1）：16-23.

[3]李朝阳，张智超，张玲，等.拟除虫菊酯农药和氰戊菊酸手性分离的研究[J].分析试验室，2006（11）：11-14

[4]邓仁菊，范建新，蔡永强.国内外火龙果研究进展及产业发展现状[J].贵州农业科学，2011，39（6）：188-192.

[5]王会会，符碧海，戴俊，等.火龙果溃疡病菌的鉴定及室内药剂筛选[J].中国南方果树，2016，45（1）：8-12，17.

[6]董兆克，吴学宏，耿丽华，等.北京市西瓜甜瓜病虫害化学防治现状及展望[J].中国瓜菜，2014，27（5）：71-75.

[7]Wang Z H，Yang T，Qin D M，et al.Determination anddynamics of difenoconazole residues in Chinese cabbage andsoil[J].Chinese Chemical Letters，2008，19（8）：969-972.

[8]Dong F S，Li J，Chankvetadze B，et al.Chiral TriazoleFungicide Difenoconazole：Absolute Stereo chemistry，Stereoselective Bioactivity，Aquatic Toxicity，andEnvironmental Behavior in Vegetables and Soil[J].Environmental Science&Technology;，2013，47（7）：3386-3394.

[9]陈树兵，湛江华，徐银君，等.苯醚甲环唑、氟虫脉在小松菜中的消解动态[J].浙江农业科学，2012（4）：548-550.

[10]王绍敏，宋国春，李喆，等.苯醚甲环唑在黄瓜和土壤中的残留及安全性评价[J].北方园艺，2012（22）：127-130.

[11]Mohapatra S.Dynamics of difenoconazole and propiconazoleresidues on pomegranate over 2 years under fieldconditions[J].Environmental Science and Pollution Research，2016，23（6）：5795-5806.

[12]高川，张肖肖，覃慧丽，等.苯醚甲环唑在葡萄中的残留分析及消解动态[J].农药，2013，52（3）：202-203，206.

[13]Banerjee K，Oulkar D P，Patil S H，et al. Degradation kineticsand safety evaluation of tetraconazole and difenoconazoleresidues in grape[J]. Pest Management Science，2008，64（3）：283-289.

[14]王素琴，沈莹华，于福利.苯醚甲环唑和嘧菌酯在石榴中的残留行为与合理使用评价[J].现代农药，2017，16（6）：41-44，51.

[15]Huan Z B，Xu Z，Lv D Z，et al. Dissipation and Residues ofDifenoconazole and Azoxystrobin in Bananas and Soil in TwoAgro-Climatic Zones of China[J]. Bulletin of EnvironmentalContamination and Toxicology，2013，91（6）：734-738.

[16]周松，張玉涛，张秋云，等.三唑酮和苯醚甲环唑在草莓及土壤中残留消解动态（英文[J]. AgriculturalScience&Technology;，2017，18（10）：1873-1877.

[17]刘艳萍，王思威，刘丰茂，等.四种常用三唑类杀菌剂在香蕉上残留行为及使用评价研究[J].植物保护，2014，40（5）：100-105.

[18]贺敏.苯醚甲环唑手性异构体活性差异及其在稻田的立体环境行为[D].北京：中国农业科院，2016.

[19]李晶.三唑类手性杀菌剂苯醚甲环唑的立体选择性生物活性与环境行为研究[D].北京：中国农业科学院，2012.