土茯苓丛生芽诱导与增殖培养技术优化

梁崇 廖莉莉

摘要 为优化土茯苓的组织培养技术体系，提高土茯苓组织培养效率，促进其资源保护和合理开发利用。以土茯苓带腋芽茎段为外植体，采用组织培养方法，研究不同外源激素配比对茎段丛生芽诱导分化和不定芽增殖的影响。结果表明：土茯苓茎段丛生芽诱导分化最佳培养基为MS+6-BA1.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L，芽诱导倍数达6.35，不定芽增殖的最佳培养基为MS+6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L，其增殖数高达8.8，且芽生长良好。

关键词 土茯苓;丛生芽;诱导分化;增殖

中图分类号 S567.32 文献标识码 A

土茯苓（Smilax glabra Roxb.）为百合科菝葜属植物，为传统清热解毒常用中药，具有调中止泻、健脾胃、强筋骨、除湿、利关节等功效[1，2]。现代分析土茯苓含生物碱、挥发油、已糖类、鞣酸、植物甾醇、琥珀酸、胡萝b苷、落新妇苷、白藜芦醇、异黄杞苷、异落新妇苷、抽皮素等多种成分[3，4]。临床和药理治疗试验表明，土茯苓具有利尿、镇痛、抗癌、抗动脉硬化、抑菌抗炎及增强肌体免疫作用[5-10]。另外，土茯苓含有的甾体皂苷元为我国制作口服避孕药的主要半合成原料[11]。广西是土茯苓的道地产区，由于土茯苓功用逐年开发，其用量逐年增长，而土茯苓野生资源长年被无序利用及产地发展经济林对其生境的破坏，野生资源逐年消殆，市场货源日渐紧缺[13]。因此，开展土茯苓的人工栽培以满足市场需求势在必行。

土茯苓的人工栽培需解决种苗问题，然而土获等扦插及种子繁殖均不理想;在组培方面，只有少数学者作了一些研究[12，13]。但多采用土茯苓根茎做培养材料，一定程度上损耗了具有高药用价值的资源。本试验选择取材方便且不具有较大药用价值的土茯苓带腋芽茎段进行丛芽的诱导与芽增殖培养优化技术研究，以期变废为宝，在原有组织培养技术的基础上，进一步优化改进培养技术，为土茯苓大规模快速高效繁殖提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选用引种的土茯苓植株，取当年生嫩茎为外植体

1.2 方法

1.2.1 无菌材料处理

将土茯苓嫩茎置洗衣粉水中浸泡5min，用自来水细流水冲洗8min;在超净工作台上用0.2%HgCl₂浸泡消毒8min，然后用无菌水浸洗3～4次，每次1min;将带有嫩芽的外植体切成长约1.5cm[14]。

1.2.2 丛生芽诱导

以MS为基本培养基，添加不同浓度配比的6-苄基氨基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）、茶乙酸（NAA）。设置13种培养基，见表1。每种培养基20瓶，每瓶接种1个外植体，在培养条件含蔗糖2.5%，琼脂0.5%，温度（25±2）℃，光照时间10h/d，光照强度1500～20001x下培养[14]。培养期间定时观察丛生芽生长情况，培养粼]d后统计不定芽数。

1.2.3 丛生芽的继代增殖

将诱导获得的丛生芽分成单芽转入继代培养基中培养。设置4种培养基，见表2。培养条件与

1.2.2 相同，培养40d后统计丛生芽的增殖数。

2 结果与分析

2.1 不同细胞分裂素及其浓度对丛生芽诱导分化的影响

细胞分裂素是植物组织培养中促进组织分化和生长的物质，其不同种类及浓度对组织的分化和生长有不同程度的影响。在土茯苓茎段丛芽分化培养中，6-BA的作用效果比KT显著。6-BA在0.6～1.8，芽的诱导倍数随着浓度的升高而提高。从丛生芽数和芽的长势来看，不同浓度的6-BA对土茯苓丛生芽的诱导有很大影响。随着6-BA浓度的增加，丛生芽诱导数也不断提高，当6-BA浓度达1.8mg几时诱导丛芽数最多，诱导倍数为（3.35±0.6），比对照CK（0.4±0.48）提高了8倍多，芽较粗壮。当6-BA浓度大于1.8mg/L，丛生芽减少，严重玻璃化。在8个处理中，6-BA1.8mg/L芽诱导倍数最高，与其它各处理间存在极显著差异，其次为6-BA1.2mg/L。因此，土茯苓丛生芽分化诱导以细胞分裂素6-BA，浓度1.2～1.8mg/L为宜。结果见表3。

2.2 不同外源激素及浓度配比对丛生芽诱导分化的影响

在不同外源激素及浓度配比的培养基中土获苓茎段都有不同程度的丛生芽分化。从分化丛生芽数和芽的长势来看，以12号培养基最佳，平均芽诱导倍数为（6.35±1.01），与其它培养基存在显著性差异。相同的6-BA浓度下，添加低浓度NAA对芽的诱导有促进作用，同时减轻丛芽玻璃化;添加低浓度的KT可较大幅度提高丛芽的诱导倍数。结果见表4。

2.3 丛生芽的继代增殖

丛生芽转接于继代培养基中，在4种不同外源激素配比的继代培养基中均有不同程度的丛生芽增殖，且以16号培养基增殖最好，平均芽增殖倍数达（8.8±1.02），生长健壮，与其它增殖培养基存在显著性差异;其次是巧号培养基。结果见表5、图1。

3 讨论与结论

植物内源激素的调控是丛生芽成功诱导的重要因素。在植物组织培养过程中，外源生长物质对植物形态的分化作用实际上是重新调整了内源生长素和细胞分裂素的平衡，外植体组织中内源激素水平的不同引起培养基中最适外源生长物质浓度的变化[15]。植物的器官分化需要较严格的细胞分裂素和生长素平衡。因此，不同植物的组织培养就有不同生长物质种类及浓度的需要。在土茯苓带腋芽茎段丛生芽诱导和不定芽增殖培養试验中，适当的分裂素和生长素浓度对土茯苓丛生芽的分化有很大的影响。配比过低不利于丛生芽的诱导萌发，配比过高，则会导致丛生芽产生玻璃化。且2种细胞分裂素与生长素配比组合比单一细胞分裂素及单一细胞分裂素、生长素配比较好，这可能是因为在土茯苓离体培养中，6-BA虽是主要、需求量较大的外源细胞分裂素，但KT作为一种非天然的细胞分裂素被植物的叶、茎、缓慢吸收，其促进细胞分化、分裂、生长，诱导愈伤组织长芽的机理功能可能是6-BA所不具备的，少量KT的添加，可以使植物外植体达到一个新的完美平衡，从而促使丛生芽大幅度提高，这与廖莉莉[14]等研究的KT对金樱子芽诱导与增殖影响结果相似，添加KT比前人研究的土茯苓芽增殖及同属菝葜的嫩茎芽诱导增殖增加1倍以上[13，16]，且芽生长健壮。因此，土茯苓带腋芽茎段丛生芽诱导培养中以6-BA1.2mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L组合最好，诱导倍数可达6倍以上。不定芽增殖培养中，以6-BA1.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L组合最好，增殖倍数可高达8.8，且芽长势良好。

参考文献

[1]邓理有.土茯苓的新用途[J].药膳食疗，2004（s）：16.

[2]田君，池汝安，张越非，等.从土茯苓浸取液萃取黄酮的研究[J].解放军药学学报，2006，22（5）：340-342.

[3]沈尔安除湿毒抗癌魔的土茯苓[J].东方药膳2006（7）-21.

[4]隋欣，暴悦梅大孔树脂分离土茯苓黄酮的研究[J].食品研究与开发，2015，36（7）：48-51.

[5]张白嘉，刘亚欧，刘榴，等.土茯苓及落新妇苷抗炎、镇痛、利尿作用研究[J].中药药理与临床杂志，2004，20（1）：11-12.

[6]邱光清，许连好，林洁娜，等.土获冬总皂甙的抗肿瘤作用研究[J].中药药理与临床，2001，17（5）;14-15

[7]李强.土茯苓现代研究概述[J].中国药业，2008（14）：76-78.

[8]王志强，邱世翠，宋海英，等.土茯苓体外抑茵作用研究[J].时珍国医国药，2006，17（11）：2203-2204.

[9]殷网虎，袁武军，曹美琳.土茯苓配方颗粒对临床常见致病菌的抗菌研究[J].中国中医急症，2011，20（12）：1957-1958.

[10]徐强.土茯苓对细胞免疫和体液免疫的影响[J].中国免疫学杂志，1993，9（1）：39.

[11]黄少伟.土茯苓总黄酮与多糖的提取与分离[D].武汉：武汉工程大学，2008.

[12]曾宋君，昊坤林，陈国华，等.土茯苓离体快繁研究[J].中药材，2005，28（1）：1-2.

[13]董青松，闫志刚，白隆华，等.土茯苓组织培养研究[J].中药材，2014，37（1）：5-9.

[14]廖莉莉，蓝祖栽，凌征柱金樱子组织培养及植株再生研究[J].现代中药研究与实践，2010，24（6）：22-24.

[15]肖尊安.植物生物技术（M].北京：化学工业出版社，2005：16-17，55-56.

[16]李青.菝葜组织培养及植株再生体系的建立[D].雅安：四川农业大学，2008：49.