烟草黑胫病拮抗芽孢杆菌的筛选及生防效果评价

施河丽　谭军　丁才夫

摘要：为了防治烟草疫霉对烟草引起的病害，从不同烟田健康烟株根际土壤中筛选分离42株根际细菌，经平板对峙初筛、细菌发酵液115 ℃处理后复筛得到10株对烟草黑胫病病原菌（Phytophthora parasitica）具有较好抑制效果的芽孢杆菌。经分子生物学鉴定可将其分为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）和贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）3类。选取枯草芽孢杆菌GJ1、解淀粉芽孢杆菌GJ7和貝莱斯芽孢杆菌GJ11对各类芽孢杆菌进行纤维素酶和蛋白酶分泌特性检测、烟草根际土壤、根和茎定殖能力检测以及田间试验，得出这3种芽孢杆菌均可分泌纤维素酶和蛋白酶，均能在烟草根际土壤、根和茎中定殖，在根际土壤中定殖能力为GJ1>GJ7>GJ11，在根和茎中定殖能力均为GJ7>GJ1>GJ11。GJ1、GJ7、GJ11对烟草黑胫病田间相对防治效果分别为33.33%、80.00%、28.60%，初步确定拮抗芽孢杆菌田间防治效果取决于其在烟草内定殖能力。

关键词：烟草黑胫病病原菌（Phytophthora parasitica）；拮抗细菌；定殖能力；防治效果

中图分类号：S476；S435.72 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2018）18-0060-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.18.014 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Selecting of Antagonistic Bacillus against Tobacco Black Shank and Detecting of Control Efficacy

SHI He-li，TAN Jun，DING Cai-fu，ZHAO Xiu-yun，XIANG Bi-kun，LUO Fang

（Enshi Tobacco Company of Hubei Province，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： In order to control the tobacco black shank caused by Phytophthora parasitica var. nicotianae，42 bacterial strains were isolated from different health status tobacco rhizosphere soil，10 of them had an antagonistic effect on P. nicotianae by using the plate confronting method and treatment with fermentation filtrate after heated at 115 ℃. Three groups of Bacillus could be identified under the 16S rDNA sequence analysis：Bacillus amyloliquefaciens， B. subtilis and B. velezensis. The characteristics of cellulase and protease activity，colonization of Bacillus in tobacco rhizosphere soil，root and stem，and field experiments were carried out on B. subtilis GJ1，B. amyloliquefaciens GJ7 and B. velezensis GJ11. The results showed that GJ1，GJ7 and GJ11 strains could secrete cellulase and protease，and colonize in the rhizosphere soil，root and stem of tobacco. The ability of colonization in the rhizosphere soil was GJ1>GJ7>GJ11，in root and stem was GJ7>GJ1>GJ11. However，the control efficiency against tobacco black shank of GJ1，GJ7 and GJ11 were 33.33%，80.00% and 28.60%，respectively，suggesting that the control efficacy in field of antagonistic Bacillus may depend on its colonization ability in tobacco.

Key words： Phytophthora parasitica； antagonistic bacteria； colonization； control efficacy

烟草黑胫病是一种严重影响烟草生长的土传真菌病害，由烟草黑胫病病原菌疫霉菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）引起。主要发病期在烟草的成株期，病原侵染茎基部，以根茎部发病为主，向髓部扩展，病株叶片自下而上依次变黄，直至整株烟草枯死，给烟草种植带来巨大的经济损失[1]。近年来有关防治措施主要有化学防治、轮作、抗病品种选育等，但这些措施都存在缺陷。长期使用化学药剂可导致病原菌耐药性增强、烟叶农药残留、污染环境[2]，使用抗病品种会使烟叶质量下降，给卷烟的安全性和烟叶出口带来严重的不利影响[3]。生物防治具有无污染、无毒害、无残留、可持续、环境友好等特点，其已受到烟草病害防治的重视。

土壤中微生物种类丰富，植物根际土壤中含有促进植物生长、对植物病原菌有拮抗作用的微生物[4]。已有报道指出，从烟草根际土壤分离出对烟草黑胫病病原菌具有良好防治效果的芽孢杆菌[5]和有益真菌[6]，这些有益菌株主要通过竞争作用、抑制作用、寄生作用和诱导植物抗病性来抑制病原菌对植物的侵染[7]。因此，根据生态平衡原则分离具有拮抗功能的有益微生物是一种充分利用土壤微生物的有效策略。

本研究通过从不同烟田健康烟株根际土壤筛选拮抗烟草黑胫病病原菌的细菌，得到10株抑菌效果较好的芽孢杆菌；通过16S rDNA序列分析进行分类鉴定；同时检测菌株的纤维素酶和蛋白酶活性，以及其在烟草根际土壤、根和茎中定殖能力及田间防治效果，可为微生物农药等生物防治技术提供菌种资源，为烟草黑胫病的生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

病原菌菌种：黑胫1号菌种，实验室保藏。

PDA培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂20 g，无菌水1 000 mL，自然pH。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，无菌水1 000 mL，pH 7.0。

酪蛋白培养基：KH2PO4 0.36 g，Na2HPO4·12H2O 1.2 g，NaCl 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，CaCl2·2H2O 0.002 g，酪素4 g，无菌水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

纤维素刚果红培养基：K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，NaNO3 3 g，KCl 0.5 g，羧甲基纤维素纳10 g，琼脂20 g，無菌水1 000 mL，pH 5.5，121 ℃灭菌20 min。

固体发酵培养基：小麦粉50 g，蛭石50 g，2%红糖水60 mL。

土壤样品：云烟87健康烟田烟株根际土壤、云烟87黑胫病发病严重烟田健康烟株根际土壤。

1.2 细菌的分离

准确称取10 g土壤样品加入装有90 mL无菌水并放有小玻璃珠的250 mL锥形瓶中，置于摇床振荡30 min，静置待土样沉降至瓶底，将所得土壤浸液按照梯度稀释，分别取10-4、10-5、10-6稀释液0.1 mL于LB培养基平板上，并用无菌涂布器涂布均匀，37 ℃培养1～2 d；挑取形态差异明显的菌落进行划线分离纯化培养，斜面培养后，4 ℃冰箱保存。

1.3 拮抗细菌的筛选

初筛：将烟草黑胫病病原菌保藏菌种进行活化培养7 d，用打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌饼（直径5 mm），转接在PDA平板中央28 ℃培养48 h后，将分离到的细菌菌株点接在距烟草黑胫病病原菌菌片25 mm处，每皿接种4个菌株，同时设空白对照（不接菌），重复3次，28 ℃培养7 d，观察抑菌效果。选择抑菌效果显著的菌落进行纯化，并保存。

复筛：通过测定各细菌的抑菌圈宽度，选取抑菌圈宽度大于16 mm的细菌进行抗菌活性测定。其中细菌发酵培养所用培养基为豆粕粉12 g/L、玉米淀粉15 g/L、NH4NO3 2 g/L、NaHPO4 2 g/L，pH 7.5。装液量为60%，以菌龄为18 h细菌按接种量5%接种，28 ℃培养48 h。将发酵后的培养液8 000 r/min离心5 min，取上清液于115 ℃灭菌10 min，按照处理后的发酵液与培养基体积比为1∶9混合后倒入平板，冷却后接入5 mm烟草黑胫病病原菌菌饼，同时以无菌水为对照，从2 d时开始到黑胫病病原菌长满整个平板，测定抑菌圈。

1.4 16S rDNA序列鉴定拮抗细菌

采用CTAB法提取拮抗细菌基因组NDA[8]。16S rDNA扩增引物和反应条件参考王亚会等[9]方法。将16S rDNA扩增产物纯化回收后测序，测序结果在GenBank数据库进行BLAST比对，通过MEGA 4.0软件对拮抗细菌进行系统发育树分析。

1.5 拮抗细菌定殖能力检测

1.5.1 细菌利福平抗性诱导 首先在LB培养基上划线活化拮抗细菌，挑取单菌落转入含1 μg/mL利福平的LB液体培养基中，于28 ℃、180 r/min培养24 h，然后在含1 μg/mL利福平的LB平板上划线培养，待单菌落长出后挑取其转入下一个梯度中，依次经过含利福平2、5、10、20、40、60 μg/mL的LB培养基诱导，直至最后筛选到稳定的抗利福平60 μg/mL的突变菌株。

1.5.2 灌根 将成功诱导的菌株用接种环挑取1～2环于LB液体培养基中，28 ℃、180 r/min培养24 h，平板计数各菌种活菌数。各菌种取50 mL培养液对烟草进行灌根处理，每种菌灌根6株烟草。灌根后7、14、21、28、45 d检测烟草根际土壤、根和茎菌体浓度。

1.5.3 内生细菌分离 将灌根处理的烟草连根际土壤一起取出，抖落根际土壤并标记；洗净多余的根际土壤，将根和茎冲洗干净，进行根、茎分离；将根和茎先用75%乙醇消毒10 s，后用0.1%升汞消毒30 s，无菌水冲洗3次；消毒后的组织放入研钵，加入无菌水（并记下无菌水体积）磨成浆状物，并稀释成不同浓度，静置3 min，取100 μL汁液涂于含60 μg/mL利福平的LB平板上，37 ℃培养24～48 h，观察统计各浓度下菌落数并计算各组织菌体含量。

组织中含菌量=[（菌落数×稀释倍数×分离用水毫升数）÷（涂板水毫升数×分离组织克数）]；

每克根际土壤含菌量=同一稀释浓度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数。

1.6 拮抗微生物分泌纤维素酶能力测定

将纯化后的拮抗细菌，用无菌牙签挑取点接在刚果红纤维素培养基上，28 ℃倒置培养1～2 d。培养结束后，向平板中加入1 mg/mL刚果红染液（以覆盖整个平板为益），10～15 min后，倒去刚果红染液，加入1 mol/L NaCl溶液，15 min后倒掉NaCl溶液，反复操作3～4次，观察是否出现水解圈。

1.7 拮抗微生物分泌蛋白酶能力测定

将纯化后的拮抗细菌，用无菌牙签挑取点接在酪蛋白培养基上，28 ℃倒置培养3～5 d观察是否出现水解圈。

1.8 田间试验

1）地理环境。田间试验在襄阳市南漳县薛坪镇栗林坪村进行，该地土壤为黄棕壤，质地疏松，肥力中等，通透性好。

2）试验药剂。将拮抗细菌在含利福平浓度为30 μg/mL的LB培养液中于37 ℃ 180 r/min培养12～16 h，按2%接种量接入固体发酵培养基中，37 ℃培养7 d后自然干燥用于田间试验。

3）处理与药剂用量。设置4个处理，分别为枯草芽孢杆菌GJ1、解淀粉芽孢杆菌GJ7、贝莱斯芽孢杆菌GJ11、霜霉威盐酸盐。施用方法：拮抗细菌固体发酵菌粉各200 g，霜霉威盐酸盐（有效含量66.5%）80 mL加至50 L水中，每株烟草灌根200 mL。共施用2次，移栽后15、30 d各施用1次。每个处理分为两行，每行64株烟草。

4）调查、记录和测定方法。①调查时间和次数。共调查2次，移栽当天调查1次（病情基数），此后每隔15 d调查1次。②调查方法。以株为单位，调查发病分级标准，按国家烟草病害调查分级标准GB/T23222-2008[10]进行。③药效计算方法。病情指数=[Σ（各级病株×该病级值）/（调查总株数×最高级值）]×100。防治效果（相对防效）=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100%。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的初筛

从健康烟田烟株根际土壤中共分离纯化获得细菌31株，其中通过平板对峙初筛得出对烟草黑胫病病原菌有抑制作用的细菌有8株，拮抗菌分离率为25.81%；从发病严重烟田健康烟株根际土壤中共分离纯化获得细菌11株，其中通过平板对峙初筛得出对烟草黑胫病病原菌有抑制作用的细菌有7株，拮抗菌分离率为63.64%。图1显示两种土壤中对烟草黑胫病病原菌有拮抗作用的部分细菌。

2.2 拮抗细菌的复筛

如表1所示，比较细菌发酵液高温处理后对烟草黑胫病病原菌的抑菌活性，进行复筛，得出高温处理后的细菌发酵液处理烟草黑胫病病原菌48 h后，抑菌率大于40%的细菌有10株，且各细菌对烟草黑胫病病原菌的抑菌率随时间延长而减小。对照组菌丝向外延伸，而处理组的菌丝则向中心聚拢，菌落生长明显被抑制（图2）。表明各细菌可产生耐高温的抗菌活性物质。其中，抗菌活性最高的菌株为GJ11，48 h的抑菌率为73.24%。

2.3 拮抗细菌16S rDNA序列分析及分子生物学鉴定

提取复筛得到的10株细菌基因组DNA，并以此为模板扩增各细菌16S rDNA，可得出各自大小约为1 200 bp的条带。经测序后，将各自序列在NCBI上用Blast分析，得出10株细菌，可分为3个不同的种。GJ1、GJ6属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），与B. subtilis YB-6（KT377368.1）的相似性为98%。GJ3、GJ7、H11、H12、H13属于解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens），与B. amyloliquefaciens HXD-5（KP900947.1）的相似性为99%。GJ9、GJ10、GJ11属于贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis），与B. velezensis BH21（KT889363.1）的相似性为100%。利用MEGA4.0的Maximum Composite Likelihood模型，采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树，结果见图3。

2.4 纤维素酶和蛋白酶分泌特性检测

从3种不同种属芽孢杆菌中选取相应种属进行纤维素酶分泌能力与蛋白酶分泌能力的检测。将GJ1、GJ7、GJ11分别接种在刚果红纤维素培养基上培养24 h，经刚果红染色处理后可在平板上出现明显的水解圈（图4a）。说明3种芽孢杆菌都有分泌胞外纤维素酶的特性。将3种芽孢杆菌接种至酪蛋白培养基培养24 h，有明显的水解圈产生，说明这3种芽孢杆菌也有分泌胞外蛋白酶的特性（图4b）。GJ11产纤维素酶的能力优于GJ1和GJ7，而GJ11产蛋白酶能力与GJ1相当却优于GJ7，说明不同芽孢杆菌之间产纤维素酶和蛋白酶的能力有差异。

2.5 芽孢杆菌定殖能力检测

对GJ1、GJ7、GJ11 3种芽孢杆菌进行利福平抗性诱导均可成功实现利福平抗性标记。分别用LB培养液培养这3种含利福平抗性的拮抗菌株，48 h后调整发酵液浓度为108 CFU/mL，采用灌根接种烟草幼苗进行芽孢杆菌定殖能力检测。结果如图5所示，GJ1、GJ7、GJ11菌株在烟草根际土壤、根和茎均可定殖，随着灌根时间延长在烟草根际土壤中的定殖密度呈下降趋势，且定殖能力强弱表现为根际土壤>根>茎，说明这3种菌均可从烟草根际土壤进入烟草根中，并逐渐转移至烟草茎中，具有良好的转导能力。在灌根后28 d內，GJ1的定殖密度高于GJ7、GJ11，GJ1、GJ7、GJ11的定殖密度，分别是5.61×105、2.30×105、3.90×104 CFU/g，其中GJ1的定殖密度分别是GJ7、GJ11的2.4、14.4倍（图5a），说明在烟草根际土壤中3种菌的定殖能力强弱表现为GJ1>GJ7>GJ11。

在烟草根中，3种菌的定殖密度可随时间延长发生起伏变化，都有先下降后增加的过程，其中GJ7从7 d开始下降，14 d后开始上升，此后定殖密度维持不变，而GJ1和GJ11从14 d开始下降，21 d开始上升，此后定殖密度维持不变，且GJ1与GJ7定殖密度相当，GJ11明显低于前者（图5b），说明GJ7对根部环境适应做出的反应较GJ1和GJ11快，进一步说明GJ7对根部环境的适应能力优于GJ1和GJ11，也说明了在烟草根中3种菌的定殖能力强弱表现为GJ7>GJ1>GJ11。

在烟草茎部，GJ7从7 d开始上升，至14 d达最大定殖密度，为1.7×105 CFU/g，之后一直维持在2.0×104 CFU/g；GJ1从7 d下降，14 d后缓慢上升之后一直下降；GJ11从7 d一直下降，至28 d后缓慢上升，且在45 d时GJ7的定殖密度分别是GJ1、GJ11的11.02、6.96倍，说明在烟草茎中3种菌的定殖能力强弱表现为GJ7>GJ1>GJ11（图5c）。

2.6 田间试验

对3种芽孢杆菌进行田间防治效果测定（表2），结果表明，3种芽孢杆菌对烟草黑胫病均有一定的防治效果，解淀粉芽孢杆菌GJ7相对防效最佳，高达80%，其次为枯草芽孢杆菌GJ1，为33.33%，贝莱斯芽孢杆菌GJ11为28.60%，化学药剂为28.57%。表明解淀粉芽孢杆菌GJ7防治效果明显高于化学药剂，且优于枯草芽孢杆菌GJ1和贝莱斯芽孢杆菌GJ11。

3 讨论

烟草黑胫病是一种土传真菌病害，为了找到相应的拮抗微生物有效地对其进行防治，通过在烟草根际筛选有益根际细菌再采用发酵方式生产生防菌剂施用于根部已成为一种高效可行的生防措施[11]。冯志珍等[11]从陕西省陇县烟草黑胫病高发地块健康烟株根际土中筛选分离得到1株拮抗活性较好的解淀粉芽孢杆菌FB-6，本研究除了从发病严重烟田健康烟株根际土壤筛选拮抗细菌外，同时也在健康烟田烟株根际土壤中分离拮抗细菌，结果发现发病严重烟田健康烟株根际土壤拮抗菌分离率高于健康烟田烟株根际土壤。因此，依据生态平衡原理分离拮抗微生物菌株是一种常用策略。

本研究从健康烟田烟株根际土壤与发病严重烟田健康烟株根际土壤共分离出3种不同种属的芽孢杆菌，但王丽珍等[12]从烟草根际土壤中除分离到具有拮抗作用的芽孢杆菌外，同时还有24株为荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）也具有拮抗作用。说明根际土壤微生物资源丰富，可为生物防治技术提供可靠支撑。已有报道指出芽孢杆菌生防机制主要为抗生、竞争、促进生长、诱导抗性等[13，14]，就抗生而言有人指出该特性与芽孢杆菌可产生多种多样的抗菌物质有关，主要包括抗生素、细菌素、细胞壁降解酶类、抗菌肽以及其他挥发性的抗菌物质等[15]。何浩等[16]发现B. amyloliquefaciens X030可产生一个对病原细菌与植物病原真菌具有较强抑制作用的多肽。Arrebola等[17]發现B. amyloliquefaciens PPCB004产生的Iturin A家族脂肽类化合物对植物病原真菌具有很好的抑制效果。本试验通过用高温处理细菌发酵液后作用于烟草黑胫病病原菌复筛，从中得到10株具有较高拮抗活性的拮抗细菌，经分子生物学鉴定全部为芽孢杆菌，对其代表种属菌株进行纤维素酶及蛋白酶活性检测发现均可分泌纤维素酶及蛋白酶。因此推测拮抗芽孢杆菌抑菌机制可能与其分泌的纤维素酶能有效分解纤维素、分泌的蛋白酶能抑制与病原菌正常生长相关菌体蛋白的合成，从而水解病原菌的细胞壁，抑制烟草黑胫病病原菌的生长有关，也可能与芽孢杆菌产生的某种耐高温物质如脂肽或挥发性物质有关，这种耐高温物质有待于进一步研究。

拮抗细菌根部定殖被认为是有效生物防治必备条件，在抑制植物土传病害中起到重要作用[18]。拮抗细菌定殖于植物组织抑制病原菌可能与其生物膜的形成、竞争植物寄生病原菌生态位和营养、引起植物诱导系统抗性有关。Ren等[19]利用Paenibacillus polymyxa C5制成的有机肥施用于烟草根部可使烟草黑胫病发病率降低50%，进一步研究得出主要抑菌机制与其可在烟草根部稳定定殖有关。Lee等[20]从野生人参中分离一株解淀粉芽孢杆菌HK34可引起人参诱导系统抗性有效抑制恶疫霉生长。本研究利用利福平标记拮抗芽孢杆菌，在不同时间点回收带有利福平抗性的芽孢杆菌，探究3种拮抗芽孢杆菌在根际土壤以及烟草根和茎组织中的定殖情况，发现解淀粉芽孢杆菌GJ7在根部和茎部定殖能力较另外两种芽孢杆菌好。通过田间试验比较发现，GJ7防治效果明显高于化学药剂和定殖能力较弱的另外两种芽孢杆菌，从而证明了拮抗芽孢杆菌田间防治效果与植物组织定殖能力有关。

下一步将从芽孢杆菌引起植物诱导系统抗性进行深入研究，为芽孢杆菌在生物防治中的应用提供理论基础。

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