新疆籽用西瓜ISSR反应体系的建立及其遗传多样性研究

林明，邓超宏，潘竟海，陈友强，刘华君，白晓山，肖丽，李承业

(新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】籽用西瓜(Citrulluslanatusvar.megulasnemusL.)，别名籽瓜，俗称打瓜。籽用西瓜的主要利用部位是种子，其种子含有丰富的蛋白质成分和植物油。籽瓜瓤具备低脂、低糖、低热量的特性，食用籽瓜瓤可起到利尿、润肺、益肝、健脾等功效[1]。籽瓜适合在干旱、少雨、冷凉等环境下生长，新疆是中国籽瓜的最大产区，符合籽瓜生长的地区有昌吉、伊犁、巴音郭楞蒙古自治州、乌鲁木齐、阿勒泰等地区，根据籽瓜的籽粒大小和颜色，将籽瓜分类为大片、小片和黑籽瓜、红籽瓜[2]。在籽用西瓜种植生产中，由于品种混乱、品质参差不齐，常导致病害频发，产量低而不稳等情况发生。籽用西瓜的发源地并不是中国，自身资源也非常稀少，育种材料的亲缘关系较单一，致使籽用西瓜在育种方面进展缓慢[3]。研究籽瓜育种材料之间的亲缘关系非常必要，通过研究适宜的亲缘关系和遗传育种方式，将来自不同生态环境的个体在相同条件下种植，结合形态学分析与ISSR分子标记技术对籽瓜材料进行分类和遗传多样性的研究，研究籽用西瓜种间与种内的遗传关系，对扩展籽瓜育种材料和培育新品种具有实际意义。【前人研究进展】分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[4]，常用的分子标记有RAPD、AFLP、ISSR等，与形态标记相比，DNA分子标记具有一定的优越性。为了促进西瓜的遗传育种工作，分子标记技术在西瓜育种上的应用上已有大量的研究报到，但在籽用西瓜上却罕见报到[5-9]。【本研究切入点】应用分子标记研究籽瓜种质资源，利用不同类型种质资源的多态性，达到籽用西瓜种质资源的创新是当今籽用西瓜分子育种工作的发展方向[10-11]。ISSR(Inter-simple sequence re-peat，简单重复序列间扩增)是基于PCR标记系统的一种新型的显性分子标记技术。其标记为共显性，对隐性的农艺性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；检测手段简单、迅速。ISSR标记技术如今已经广泛应用于西瓜种质资源的遗传多样性分析、品种的亲缘关系鉴定，以及分子遗传图谱的构建等方面的研究[12-17]。【拟解决的关键问题】以60份籽用西瓜种质资源为材料，利用ISSR分子标记技术分析籽用西瓜种质资源进行遗传多样性，为籽用西瓜分子育种打下基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

籽用西瓜种质资源于2015年5月种植于新疆奇台县西地镇试验田，选取其中表型较好、产量优异的60份材料进行遗传多样性分析。表1

表1 60份籽用西瓜品种(系)名称及形态特性
Table 1 Source and biological characteristics of 60 Seed-Watermelon Cultivars

序号No.品种名称Name of lines来源Sources籽色Color大小Size序号No.品种名称Name of lines来源Sources籽色Color大小Size1SWBB-01新疆黑大3140023新疆红大2黑皮大板3甘肃黑大3240024甘肃红中3黑中片新疆黑中3340026宁夏红大4林籽1号甘肃黑大3440026-1广西红中5内蒙黑中片内蒙古黑大3540026-2广西黑大6普通黑小片新疆黑小3640027江西红中7新籽瓜1号新疆黑大3740027-1江西红大8新籽瓜8号新疆黑大3840028广西红中9红秀1号甘肃红小3940028-1广西红中10红秀2号甘肃红大4040029广西红大11普通红大片甘肃红大4140029-1广西红中12新籽瓜4号新疆红小4240029-2广西棕中13紫荆红新疆红小4340030江西红中1440002甘肃红小4440032内蒙古黑大1540004甘肃褐小4540035内蒙古红中1640008甘肃红中4640035-1内蒙古红小1740009甘肃红中4740036内蒙古红小1840009-1甘肃红小4840037内蒙古红小1940011甘肃棕小4940037-1内蒙古红中2040012甘肃红小5040043宁夏黑小2140013甘肃黑中5140043-1宁夏黑中2240013-1甘肃棕小5240045宁夏红小2340013-2新疆红小5340045-1宁夏红中2440013-3新疆黑小5440047新疆黑大2540014新疆黑中5540049新疆黑大2640014-1新疆黑小5640060新疆棕大2740015新疆褐小5740060-1新疆黑大2840018新疆红小5840063新疆棕大2940020新疆红大5940065新疆棕中3040022新疆红中6040067新疆黑大

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取和纯化

取籽用西瓜幼苗叶片约0.20 g，经液氮冷冻，研钵内研磨成粉末。用DNA提取试剂盒提取叶片中的基因组DNA(北京天根)。利用核酸蛋白检测仪(BioPhotometerplus，Eppendorf)测定DNA浓度，将DNA样品稀释到备用浓度，置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 ISSR-PCR反应体系的建立

对反应体系中的模版DNA、dNTPs、引物、Mg2+、Taq酶5因素采取4水平的正交试验。正交试验所用引物为UBC862，ISSR-PCR反应体系总体积为15 μL，其中10×Buffer2.5 μL，Mg2+2.5 μL，Taq酶0.3 μL，引物1 μL，dNTP 1 μL，DNA 1 μL，加ddH2O补齐至总体积为15 μL。表2，表3

表2 籽瓜ISSR-PCR反应体系正交试验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels of ISSR-PCR system of seed-used watermelon in orthogonal design

水平LevelMg2+(mmol/L)Taq-polymerase(U)Primer(μmol/L)dNTPs(mmol/L)DNA(ng)11.41.00.10.1254021.61.20.20.1505031.81.40.30.1756042.01.60.40.20070

表3 籽瓜ISSR反应条件正交组合设计
Table 3 Orthogonal design for ISSR-PCR optimization of seed-used watermelon

水平LevelMg2+(mmol/L)Taq-polymerase(U)Primer(μmol/L)dNTPs(mmol/L)DNA(ng)11.41.0 0.10.1254021.41.2 0.20.1505031.41.4 0.30.1756041.41.6 0.40.2007051.61.2 0.30.1257061.61.0 0.40.1506071.61.6 0.10.1755081.61.4 0.20.2004091.81.4 0.40.12550101.81.6 0.20.15040111.81.0 0.30.17570121.81.2 0.10.20060132.0 1.6 0.30.12560142.0 1.4 0.10.15070152.0 1.2 0.40.17540162.0 1.0 0.20.20050

1.2.3 多态性ISSR引物筛选

ISSR引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根据已建立的ISSR-PCR反应体系，以编号1材料的基因组DNA为模板，对100条ISSR引物进行多态性筛选，从中选取扩增条带清晰，条带数较多，重复性较好的引物进行PCR扩增。表4

表4 10对ISSR引物的编号及序列
Table 4 Serial numbers and sequences of 10 ISSR primers

引物编号Primer number引物序列Primer sequence(5′-3′)引物编号Primer number引物序列Primer sequence(5′-3′)UBC 808AGAGAGAGAGAGAGAGCUBC 861ACCACCACCACCACCACCUBC 814CTCTCTCTCTCTCTCTAUBC 862AGCAGCAGCAGCAGCAGCUBC 815CTCTCTCTCTCTCTCTGUBC 867GGCGGCGGCGGCGGCGGCUBC 824TCTCTCTCTCTCTCTCGUBC 886VDVCTCTCTCTCTCTCTUBC 826ACACACACACACACACCUBC 899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA

1.2.4 ISSR标记扩增及电泳检测

PCR扩增反应在Bio-RadPTC200PCR仪(Bio-Rad公司)上进行，扩增程序为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸10 min；4℃保存。PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像仪拍照并保存。

1.2.5 籽用西瓜遗传多样性

用筛选出的引物对60份籽用西瓜材料进行ISSR-PCR扩增和遗传多样性分析。将每条ISSR引物的扩增条带进行编号阅读，编号顺序按照扩增条带的分子量从大到小排列。在相同迁移率位置上，有带记为“1”，无带记为“0”，以数字数据记录图形数据，存于Excel表格。把Excel表格中的0、1序列数据阵导入NTSYS-PC 2.10e软件中，进行运算处理，获得参试品种遗传相似系数的变异范围，以及从Excel中得出ISSR引物的多态性信息量(PIC)的变化范围，从而构建出供试60份籽用西瓜种质资源的聚类图进行遗传多样性分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验

对16个反应体系进行测试和比较，结果显示，反应体系16的扩增效果最好，将其确定为籽用西瓜的最佳ISSR-PCR反应体系，具体参数为：PCR扩增总体积15 μL，其中10×Buffer1.5 μL，Mg2+(2.0 mmol/L)2.5 μL，Taq酶(1 U/μL)0.3 μL，引物(0.2 μmol/L)1 μL，dNTP(0.2 mmol/L)1 μL，DNA(50 ng)1 μL，ddH2O 7.7 μL。图1

2.2 ISSR标记的多态性

利用最佳的籽用西瓜ISSR-PCR反应体系，从引物中筛选出10个条带清晰、多态性高、重复性好的引物(UBC808、814、815、824、826、861、862、867、886、899)，对60份籽用西瓜材料进行PCR扩增。共扩增出44条条带，其中多态性条带24条，多态性比率54.55%，每对引物等位变异数3～7个，10对引物平均多态性等位变异数4.4。10对ISSR引物的多态性信息量(PIC)的变化范围为0.042 3～0.674 0，平均值为0.358 2。表5

图1 籽用西瓜ISSR-PCR反应体系正交试验设计扩增结果(引物为UBC862)
Fig.1 Amplification results of primer UBC862 in ISSR-PCR orthogonal experimental design of seed-used watermelon

表5 ISSR扩增多态性位点
Table 5 Polymorphic loci analysis of ISSR amplification

位点Loci退火温度Annealing temperature(℃)等位位点数No.of alleles多态性位点数No.of polymorphic alleles多态性比率Ratio of polymorphic alleles(%)UBC-808514375.00%UBC-814544250.00%UBC-815563133.33%UBC-824524250.00%UBC-826506466.67%UBC-861543133.33%UBC-862524375.00%UBC-867534250.00%UBC-886557342.86%UBC-899515360.00%总计Total—4424—平均Average—4.42.4—

2.3 参试品种(系)遗传多样性

利用NTSYS-PC 2.10e遗传分析软件，根据ISSR标记数据计算出品种间的遗传相似系数(GS)。60份参试品种遗传相似系数的变异范围为0.318～0.992，平均值为0.779。材料13(紫荆红)与材料47(40036)间的遗传相似性最低，为0.318。材料31(40011)与材料32(40013)、49与51、22与28、19与26、36，38、59间的遗传相似性最高，为0.992。

根据各籽用西瓜品种的遗传相似系数矩阵，利用UPGMA法进行聚类分析。以聚类结果绘制DNA指纹图谱。以遗传相似系数0.70为界限，将60份籽用西瓜材料划分为6个组群。第一组为材料47(40036)，第二组为材料8(新籽瓜8号)，第三组为材料10(红秀2号)、11(普通红大片)、12(新籽瓜4号)、13(紫荆红)、14(40002)、15(40004)、16(40008)，第四组为材料7(新籽瓜1号)，第五组为材料52(40045)，其余的都归类为第六组。图2

图2 基于ISSR标记的60份籽用西瓜种质聚类图
Fig.2 Dendrogram of cluster analysis based on ISSR of 60 Seed-watermelon

3 讨 论

柳唐镜等[18]利用RAPD分子标记对野生型籽用西瓜和栽培红籽瓜进行遗传多样性分析，结果显示，野生型与栽培型红籽瓜种质间遗传距离较远，野生种类型之间的遗传距离也相对较远，而栽培籽瓜种质间亲缘关系很近。ISSR分子标记技术在西瓜上的应用广泛，刘海洋[19]通过正交设计建立了西瓜ISSR反应体系；黄歆贤等[20]在西瓜种子真实性和纯度鉴别中发现，利用2条ISSR引物将18个西瓜品种互相鉴别，ISSR分子标记是西瓜品种鉴定的有效指纹分析工具，在杂交种种子质量检测过程中也同样有效。植物品种资源的遗传多样性研究是优异品种选育的基础，通过表型的系统分析和分子标记可有效区分和挖掘特异优异资源并进行品种改良，如番茄[21]、辣椒[22]。研究中，60个材料按相似性系数共聚为6个类群，多数籽粒颜色相同的品种材料其亲缘关系表现较劲，在1～5组的分类都是按颜色区分；在第3组中，品种材料的籽粒颜色都为红色；根据来源区分，虽然新籽瓜4号和紫荆红来源于新疆，其余的材料都来自于甘肃，但是这两个材料的亲本都来自于甘肃的资源材料，来源相同、籽粒颜色相同的品种材料间亲缘关系也较近。在第6组中的品种材料，群体大且各个地方的都有，因为种质资源的流通量比较大，在选育过程中选择了相同的亲本导致的。

4 结 论

对60份籽用西瓜品种进行扩增，共扩增出44个为多态性位点，多态性比率为54.55%；核心引物的PIC值变幅为0.042 3～0.674 0，平均值为0.358 2，表明ISSR标记在60份籽用西瓜品种间均可以反映较丰富的遗传多样性信息。ISSR分子标记相对于其他分子标记具有更好的稳定性和多态性，对于基因多态性的发现非常有用，因而是非常实用的分子标记。ISSR对籽用西瓜种质资源的遗传多样性和亲缘关系的确定相比其他分子标记更有优势，更为全面的基因组DNA信息，为杂交育种亲本间的组配上提供了可靠的分子水平信息，ISSR分子标记是籽用西瓜种质资源研究遗传基础差异性和亲缘关系高效、快捷的新技术。