高粱种子萌发期耐盐材料的筛选与鉴定

王春语，张丽霞，王 平，丛 玲，于惠琳，黄瑞冬

(1.辽宁省农业科学院创新中心，辽宁沈阳 110161;2.辽宁省农业科学院玉米研究所，辽宁沈阳 110161;3.沈阳农业大学农学院，辽宁 沈阳 110866)

【前人研究进展】由于不合理的开荒种地和大 力发展灌溉农业，全世界盐碱化土地面积逐年增加。如何利用和改良盐碱化土地，如何筛选、培育出耐盐碱能力强的品种是解决这一问题的主要途径。全世界大批专家学者致力于植物耐盐碱研究领域，且在拟南芥［1］、水稻［2］、玉米［3］、小麦［4］和谷子［5］等植物中已经开展了深入的研究。高粱具有极强的耐盐碱、耐旱和耐贫瘠能力，高粱也是粮食、饲料、酿造等多种用途的作物，且高梁基因组较小(约730 Mb)，被认为是研究耐盐碱特性的重要模式作物［6］。由于高粱特殊的研究价值和经济价值，近年来受到大家越来越多的关注。国内外有关高梁耐盐性研究的报道也越来越多，甜高粱在盐胁迫条件下，通过转录组高通量测序的方法挖掘到大量与盐胁迫响应以及糖积累有关的基因［7］。甜高粱在盐胁迫条件下，耐盐材料和盐敏感材料在Na+、Cl－和K+离子积累方面差异较大，SSV84在－1.6MPa盐胁迫下，不论是种子萌发期还是苗期都表现出很强的耐盐性，并且盐敏感甜高粱材料Na+和Cl－离子浓度在茎秆和根中积累的量远远高于耐盐材料;而K+离子的量在耐盐品种中大量积累，在盐敏感材料中迅速下降。K+/Na+离子浓度的比值在耐盐材料中远高于盐敏感材料。因此，在筛选、鉴定耐盐材料时，K+/Na+离子浓度的比值是一个重要的参考指标［8］。其他的学者同时也挖掘到一些与盐胁迫响应有关的基因以及 QTLs，如 SbHKT1;4、SbVPPase和 P5CS1等［9－12］。到目前为止，有关高粱耐盐方面的研究主要集中在形态结构、生理指标和和耐盐基因挖掘等方面，但是系统全面地对高粱耐盐性的研究并不多。

【研究意义】不同高粱材料和不同生育时期的耐盐性差异较大，筛选各个时期的耐盐材料对指导盐碱地高粱种植、实现高产稳产均具有重要的意义［13－14］。【本研究切入点】萌发期是作物生长的关键时期，对作物群体数量和结构具有重要的决定作用。高粱种子萌发期耐盐材料的筛选、鉴定等相关研究较少，涉及的材料数量以及地域有限，且种子萌发期耐盐性有效的评价指标也是有待探讨的问题。

关于高粱耐盐材料的筛选、鉴定，前人也有相关的研究报道［15］。张云华等以7个不同高粱品种为试材，对萌发期和苗期的耐盐性进行鉴定，不同品种间耐盐性差异较大，并且杂交种的耐盐性明显高于亲本，并且提出了盐碱地适宜的方法是培育更加耐盐的杂交种［14］。高凤菊等对14个甜高粱品种的种子萌发进行胁迫处理，结果同样表明杂交品比常规品种耐盐性强［16］。那么，筛选耐盐性更强的材料作为杂交亲本就显得更加重要。孙璐等利用150 mM NaCl对42个高粱品种的种子萌发进行胁迫处理，10 d后统计发芽率、根长、叶长、根重、叶重等指标，通过主成分分析、聚类分析和对各品种的表现对不同高粱的耐盐性进行筛选与鉴定，结果表明150 mM NaCl可以作为高粱种子萌发期耐盐性筛选鉴定的适宜浓度，并且根长、叶重和发芽率等是非常实用的筛选指标［17］。上述文献都是关于高粱种子萌发期耐盐材料的筛选与鉴定等方面的研究，但是筛选的材料数量太少，难以筛选到耐盐等级很高的材料。【拟解决的关键问题】因此，需要扩大筛选材料的数量以及材料来源地域，设置合理有效的筛选指标和方法。

本实验选用NaCl(模拟盐胁迫)对供试材料进行盐胁迫处理，共设立 0%(对照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%11个不同浓度梯度，通过统计出苗率判定耐盐性的强弱。通过不同浓度梯度NaCl处理粒用高粱BTx623和甜高粱Rio统计出苗率，初步确定高粱种子萌发期适宜的NaCl筛选浓度为1.2%。筛选出来的材料加大选择压力进一步筛选，最终获得种子萌发期耐盐性强的高粱材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

396份供试材料由国际热带半干旱地区作物研究所(ICRISAT)提供的微核心种质191份，中国国家作物种质库中期库提供国内农家种189份，辽宁省农业科学院创新中心国家高粱改良中心提供国内常规品种8份以及黑龙江农科院提供的8份国内常规品种。材料涉及中国以及全球不同地区(非洲、亚洲、美洲和北美洲等)、不同类型(甜高粱、粒用高粱、草用高粱、帚用高粱和国内农家种)的高粱材料。地区的广泛性和品种的多样性更有利于筛选到优良的耐盐材料。

1.2 试验方法

以粒用高粱BTx623和甜高粱Rio为代表，利用国产MGC-350HP-2型人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司)，采用 NaCl模拟盐胁迫，设置0%(CK)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和 2.0%不同浓度梯度处理，确定初步筛选的NaCl浓度。然后以NaCl初筛浓度对收集到的396份高粱材料进行初步筛选，耐盐能力较强的材料不断加大选择压力，最终筛选出高粱种子萌发期强耐盐能力的材料。

选取籽粒饱满、均匀一致且无病虫害的风干种子100粒，放在垫有三层滤纸的发芽盒中，分别加入等体积的无菌水和不同浓度NaCl处理液，将发芽盒置于人工气候箱25℃处理5 d(16 h Light/8h Dark)后统计种子的萌发率，7 d后统计种子的出苗率。萌发以种子露白为标准，出苗以2片子叶变绿展开为标准。

相对萌发率=(处理后5 d种子的实际萌发率/对照种子萌发率)×100%

相对出苗率=(处理后7 d种子的实际出苗率/对照种子出苗率)×100%

表1 相对萌发率、相对出苗率统计标准Table 1 The statistical standards of the relative germination rate and relative seedling-emergence rate

试验重复2～3次，求平均值进行统计，统计标准如表1。

2 结果与分析

2.1 NaCl初步筛选浓度的确定

为了确定适宜的NaCl模拟盐胁迫的筛选浓度，以粒用高粱BTx623和甜高粱Rio为试验材料，采用0%(CK)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8% 和 2.0% 不同浓度NaCl处理5 d后统计相对萌发率和7 d后统计相对出苗率。如图1所示，粒用高粱BTx623和甜高粱Rio在不同浓度NaCl处理下，两份材料的相对萌发率和相对出苗率变化趋势一致，即随着NaCl浓度的增加，相对萌发率和相对出苗率逐渐降低，但两者之间差异不显著。当盐浓度较低时，低盐胁迫对种子的萌发率影响较低，即使NaCl浓度达到1%时，BTx623和Rio的相对萌发率都达到85%以上。当NaCl浓度达到1.2%时，两者的相对萌发率明显下降。当NaCl浓度达到1.4%时，BTx623和 Rio的相对萌发率下降幅度很大。当NaCl浓度达到1.8%时，BTx623和Rio的相对萌发率不足20%。当NaCl浓度达到2.0%时，BTx623和Rio萌发率特别低，甚至不能萌发。如果以相对萌发率作为种子萌发阶段的一个筛选指标，NaCl浓度为1.2%时较为适宜。

图1 NaCl不同浓度梯度处理下，BTx623和Rio相对萌发率和相对出苗率统计Fig.1 Treatment with different concentration of NaCl，statistic of the relative germination rates and relative seedling-emergence rates of BTx623 and Rio

盐胁迫对种子出苗率的影响远远大于对其萌发率的影响。当NaCl浓度在0.8%以下时，BTx623和Rio的相对出苗率都达到85%以上，对出苗率的影响较小，没有造成严重的盐害。但当NaCl浓度大于1%时，两者的相对出苗率下降幅度较大。当NaCl浓度达到1.2%时，BTx623和Rio的相对出苗率不足70%。当NaCl浓度达到1.4%时，BTx623和Rio的相对出苗率下降显著不足60%。当NaCl浓度达到1.6%时，BTx623和Rio的相对出苗率下降幅度更大不足30%。当NaCl浓度达到1.8%时，BTx623和Rio的相对出苗率不足10%;当NaCl浓度达到2%时，BTx623和Rio不能出苗。经过以上的初步实验，确定大批材料的初步筛选时NaCl浓度为1.2%较为适宜。筛选出较耐盐的材料不断增加选择压力进一步筛选、鉴定耐盐能力更强的高粱材料。

2.2 高粱耐盐材料的筛选

396份高粱材料NaCl浓度为1.2%分别处理5和7 d后，分别统计相对萌发率和相对出苗率。如图2A所示，相对萌发率达到一级、二级、三级、四级和五级的样品数分别为119、132、105、39和1份，分别占总样品比例为 30.05%、33.33%、26.52%、9.85%和0.25%。相对萌发率达到60%以上的材料共有251份，占样品总数63.38%。如图2B所示，1.2%NaCl处理7 d后，相对出苗率达到一级、二级、三级、四级和五级的样品数分别为79、115、130、69和3份，分别占总样品比例为 19.95%、29.04%、32.83%、17.42%和 0.76%。相对出苗率达到60%以上的材料共有194份，占样品总数48.99%。进一步证明，低盐胁迫和中等盐浓度胁迫对种子出苗率的影响远远大于对其萌发率的影响。1.2%NaCl对种子萌发期出苗率有较大的影响，但作为初步筛选压力仍然筛选出的耐盐材料较多，需要加大筛选压力。出苗率的高低才是保证作物群体数量的关键，在进一步的筛选过程中我们只关注最终的出苗率。

图2 1.2%NaCl处理下，396份高粱材料的相对萌发率和相对出苗率统计Fig.2 Treatment with 1.2%NaCl，statistic of the relative germination rates and relative seedling-emergence rates of 396 sorghum materials

图3 1.4%NaCl处理下，79份高粱材料相对出苗率统计Fig.3 Treatment with 1.4%NaCl，statistic of the relative seedling-emergence rates of 79 sorghum materials

将相对出苗率达到一级的79份材料进行1.4%NaCl处理7 d后，相对出苗率达到一级、二级、三级、四级和五级的样品数分别为3、15、45、16和0份，分别占总样品比例为 3.8%、18.99%、56.96%、20.25%和 0%(图 3A)。1.4%NaCl对出苗率影响很大，出苗率下降显著。如果筛选样品数量非常大时，采用NaCl浓度为1.4%能快速有效筛选到抗盐性较强的材料，减少下一步的筛选工作量。1.4%NaCl属于较高的筛选浓度，但是为了更进一步验证实验结果，我们将筛选压力不断增加。当NaCl浓度达到1.4%时，相对出苗率达到60%以上(即一级和二级)的18份材料进行1.8%NaCl处理，处理后相对出苗率达到60% ～79.99%为1份(二级)，40% ～59.99%为4 份(三级)，20% ～39.99%为9份(四级)，0～19.99%为4份(五级)(图3B)。

当NaCl浓度达到1.6%时，只有5份材料的相对出苗率在40%以上，为了更进一步验证这5份材料的耐盐性，继续加大NaCl筛选压力，采用1.8%NaCl处理时，结果如表2所示。采用1.8%NaCl处理时，盐胁迫浓度非常高，两片子叶能正常变绿但不能完全展开，且生长非常缓慢。当NaCl浓度达到2.0%时，种子很难正常萌发生长，超出高粱的最大耐受能力，所以继续增加NaCl处理浓度已经没有实际意义。

表2 5份高粱材料在1.8%NaCl胁迫处理下的相对出苗率统计Table 2 Treatment with 1.8%NaCl，statistic of the relative seedling-emergence rates of 5 sorghum materials

2.3 高粱种子萌发期耐盐基因定位群体构建

提高高粱种子萌发期出苗率对保障作物群体以及最终产量都具有重要的意义，因此，深入挖掘种子萌发期高粱耐盐基因迫在眉睫。利用已经筛选出来的种子萌发期耐盐性最强的5份材料L211、L004、L006、L320和 L293分别和已经测序的粒用高粱BTx623(1.8%NaCl处理下相对出苗率为6.94%±1.28%)杂交构建基因定位的RIL群体，用于挖掘高粱种子萌发期在盐胁迫下影响出苗率的盐响应基因。目前正在进行群体构建，基因还未定位。

3 讨论

作物耐盐性是一个非常复杂的过程，因此不同生育时期和不同品种间耐盐性差异很大，而且没有一个统一的衡量标准。种子萌发阶段，通常筛选指标包括相对萌发势、相对萌发率、相对萌发指数、相对活力指数、相对根长、相对叶长、相对根鲜重、相对叶鲜重、相对根干重、相对叶干重、各类酶活性检测等，但是保证出苗率才是保证最终产量的前提，因此出苗率才是种子萌发期耐盐性强弱的最直接指标，因此，本研究主要以最终的出苗率作为衡量标准。大田只有盐害的土壤几乎很少，常常伴随着不同程度的碱胁迫。实验室内模拟盐胁迫处理与大田盐碱土壤的萌发、出苗环境差异很大，因此实验室内产生的数据要到大田中重复验证。大田环境变化多样，寻找一大块盐碱浓度完全一致的试验田很困难，再加上自然环境(如降雨量的多少)的变化，很难长期保证一块地一个盐碱浓度，加大了直接利用大田来筛选大批材料耐盐碱性的难度。因此，筛选耐盐材料快捷有效的方法是在实验室内采取容易控制的环境模拟盐胁迫处理从大量的试验材料中筛选出一批耐盐性较强的材料，然后再到大田中多年多点验证。另外，不同作物不同生长发育阶段的耐盐性差异较大，种子萌发期耐盐性强的材料，在后期的苗期、拔节期、抽穗开花期和灌浆期不一定耐盐，筛选出一批耐盐性强的材料，还要注意其全生育期的耐盐性。

高粱种子萌发期选择多大的NaCl浓度处理较为合适，本实验采用不同浓度梯度的方式进行筛选确定，最终确定1.2%NaCl为大批材料的初筛浓度。孙璐等对42个高粱材料进行种子萌发期的盐胁迫处理，实验结果表明，150 mM NaCl(相当于0.88%)是高粱种子萌发期耐盐性筛选、鉴定的适宜浓度［17］。本研究采用1.2%NaCl处理，出苗率达到80%以上的材料共有79份，如果浓度降低，出苗率达到80%以上的材料会更多，增加了下一步的筛选压力。当筛选样本数很大时，应该适当提高筛选浓度。但是也不能过高，筛选一个耐盐性强的材料，应该观察这个材料在不同盐浓度处理下的出苗率和长势情况。

高粱有不同的类型，包括甜高粱、粒用高粱、草用高粱和帚用高粱等，本研究所用的396份高粱材料包含了以上几种不同的类型，但是最终筛选到5份耐盐性很强的材料都是粒用高粱，即使这样，也不能断定粒用高粱的耐盐性一定高于其他类型的高粱。相比较，到底哪种类型的高粱材料耐盐性更强，还需要更大的群体数量和其他的指标去衡量。

4 结论

通过设置不同浓度梯度NaCl处理，确定大批材料初步筛选时NaCl浓度为1.2%较为适宜。全球收集的396份高粱材料，经过不断加大选择压力，最终筛选出5份耐盐能力很强的高粱材料，其中4份来自中国、1份来自美国，且5份都为粒用高粱。

致 谢:对本研究材料的提供方辽宁省农业科学院创新中心国家高粱改良中心、国际热带半干旱地区作物研究所、中国国家作物种质库中期库和黑龙江省农业科学院表示感谢。材料收集过程中得到了邹剑秋老师和焦少杰老师的大力支持，在此提出特别感谢。