电喷雾萃取电离和电喷雾电离所获一价正离子内能差异的比较研究

张小平，钟达财，刘建川，熊剑亮，陈焕文

(1.东华理工大学，江西省质谱科学与仪器重点实验室，江西 南昌 330013；2.北京大学药学院，北京 100191)

电喷雾电离质谱(ESI-MS)技术与电喷雾萃取电离质谱(EESI-MS)技术都可用于小分子、多肽、蛋白质、核酸等的检测，在化学、生物、药学、医学、环境等领域发挥着重要作用[1-5]。ESI与EESI均属于软电离技术，二者的工作原理与分析性能既有区别也有联系。在ESI中，高压电场直接施加在流过较窄毛细管(内径100 μm)的分析样品溶液中，待测物直接暴露在高强电场(如，3 kV/m)中，经过较长时间(如，10 s)作用后流出毛细管，并在电场及辅助气作用下发生电离和雾化，产生的带电液滴经去溶等过程形成离子供后续质谱检测[6-8]。EESI与ESI显著不同，样品(一般都含有复杂基体)在电中性(即无电场作用)的条件下被气动雾化，形成微小液滴后再与由ESI产生的试剂液滴(甲醇-水)在敞开的大体积(约200 mL)空间中交叉、碰撞、融合，伴随着敞开环境中的液-液微萃取过程(约50 ms)，在三维空间内完成能荷传递作用，形成目标分子离子[3,5]。值得注意的是，EESI过程中，待测物分子或离子始终没有与强电场直接接触，而是通过沐浴在由ESI产生的带电液滴组成的“电荷雨”中获得电荷，继而经去溶等过程形成离子供后续的质谱检测。显然，在相同的实验条件下，EESI过程传递给目标离子的能量比ESI低。研究表明，EESI能够保持蛋白质的构象和生物活性[9]，而ESI条件下的蛋白经过电离的影响丧失了大部分生物活性[4]。这表明EESI比ESI更温和，且EESI与ESI在性能方面(提供给母离子的内能等)存在显著差异，但二者之间的具体内能差异尚不清楚。迄今为止，未见采用质谱仪对这两种离子源所产生的离子内能差异进行测定的方法报道。因此，有必要建立ESI与EESI内能差异的测量方法。

离子自生成后即处于激发态，具有一定的内能，碎片离子形成与否[10]、母离子不同的碎裂方式[11]均由母离子的内能大小决定。离子最初的内能来自离子源，不同类型的离子源赋予同一种离子的能量不同，导致生成离子的内能存在差异。比如，电子轰击电离源具有的能量高达70 eV，直接作用在样品分子上会产生具有高内能的自由基阳离子，剩余的能量进一步使其裂解产生碎片离子。采用温和的软电离源，产生的碎片离子较少，但可通过改变离子源的参数来诱导产生碎片离子。近年来，有文献报道离子源中离子内能的测定方法，比如温度计离子法[12]、去卷积法[13]、离子生存率法[14-15]等。温度计离子法可用来估算储存在母离子中的内能分布，主要用于在热力学方面表征离子的连续碎裂过程。去卷积法是一种确定离子内部能量的方法。离子生存率法是将分子的碎裂程度与内能相关联，主要应用在软电离中，该方法基于两个假设，即具有相同自由度的离子其内能分布相似，离子的内能在低于离子本身的解离阈值时不会发生碎裂[11]。然而，这些方法大多采用源内碰撞诱导解离(CID)技术，通过调节离子传输过程中的加速电压(锥孔电压)来计算离子内能的分布。采用源内CID技术的不足之处在于缺少母离子的选择富集过程，电离过程中产生的所有离子都会被碰撞活化，而且由于源内CID的能量比CID的能量要低些，导致碎裂的时间尺度延长，直接的碎裂解离速率小，因此，易发生重排反应，最终测定的平均内能值往往比高能量CID技术测定的平均内能值更低[11]。同时，离子生存率法没有考虑动力学位移[15]，通常需要获得比临界能更高的内能才能得到碎片离子，采用该方法测定的平均内能分布值往往比实际值偏小[11]。而CID技术可以对母离子进行选择、活化等，避免了其他离子的干扰。因此，该技术适用于分析不同离子源的内能差异。

本工作拟采用EESI-MS和ESI-MS对罗丹明B的裂解行为差异进行比较研究，通过考察不同碰撞能量对裂解行为的影响，建立EESI和ESI两种离子源一价正离子内能差异的测定方法，并对EESI和ESI的内能差异进行定量测定，希望为理解不同离子源产生离子的质谱行为提供参考依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

EESI和ESI离子源：均由本实验室自行研制搭建；LTQ-XL线性离子阱质谱仪：配有Xcalibur型数据处理系统，美国Finnigan公司产品；N2、Ar：纯度>99.999%，均为江西国腾气体有限公司产品；罗丹明B：百灵威(上海)公司产品。

1.2 质谱条件

EESI-MS/MS：线性离子阱质谱(LTQ-MS)，正离子检测模式，质量扫描范围m/z50～600。EESI使用的萃取剂为水，萃取剂和样品溶液的流速均为1 μL/min；喷雾电压4.0 kV；喷雾气压1.0 MPa(N2，纯度>99.999%)；两喷雾通道之间的角度β为60°，两喷雾口间距b为2 mm；喷雾口至质谱口的距离a为10 mm，角度α为150°；毛细管温度150 ℃；毛细管锥孔电压10 V；透镜电压30 V。整个质谱仪真空系统主要由三级差分抽气真空组成：前级真空度172.9 Pa，二级真空度0.133 Pa，离子阱(三级)真空度为1.33×10-3Pa。在进行串联质谱分析时，离子的最大进入时间为300 ms；母离子的隔离窗口宽度设定为m/z1.0；活化值Q为0.25；碰撞活化时间为30 ms；离子的冷却时间为6 ms；碰撞气体为氩气(纯度>99.999%)；碰撞能量为0%～100%。其他参数由LTQ-Tune软件系统自动优化，使m/z443离子(质子化罗丹明B)的信号强度达到最佳。

ESI-MS/MS：线性离子阱质谱(LTQ-MS)，正离子检测模式，质量扫描范围m/z50～600。ESI使用的溶剂为水；样品溶液流速为1 μL/min；其他参数同EESI-MS/MS方法。

2 结果与讨论

2.1 测定EESI与ESI内能差异的基本原理

样品溶液电离后形成离子，在毛细管传输作用下进入离子阱。从离子源引入离子阱时，离子一般具有较大的动能，这些高能量的离子必须与碰撞气体分子发生碰撞，实现离子动能的碰撞转移(冷却)，从而被束缚在离子阱的中心[16]。在串联质谱分析过程中，被电场加速的高能离子必须与碰撞气体分子发生碰撞才可以将离子的动能转化为离子内部的能量，高内能的离子进一步发生化学键的断裂生成碎片离子。因此，离子的内能来源主要包括离子化过程的能量、离子传输过程的能量和离子阱中的碰撞能量3部分。

ESI源的喷针一般设置在高电压，而离子入口设置在低电压。即在ESI过程中，样品溶液会在高电场下被加速，形成获得动能的离子，这些高动能的离子与周围的气体分子发生碰撞，将动能转化为内能。而在EESI中，目标离子产生后进入的加速电场比ESI中的加速电场弱，所以其动能和转化的内能较小。ESI与EESI产生的离子进入毛细管后，由于不存在加速电场，它们将与毛细管中处于“室温”下的中性气体发生碰撞。碰撞过程中，离子的内能会增加，同时高能量的离子会将能量传递给中性气体分子，如果碰撞足够，最后离子会被“碰撞冷却”至室温。

理论上，同一物质(保持浓度、溶剂等参数不变)在相同的传输条件下或相同的碰撞能量下获得的能量相同。那么，如果保持传输条件与碰撞条件一致，离子化过程的能量差异即为离子所获得的内能差异。离子内能变化直接体现为离子丰度行为的差异。为了测定两种离子源的内能差异，实验研究了串联质谱中不同碰撞能量条件下两种离子源时罗丹明B的质谱裂解行为差异。可根据下面的计算方法快速地测定两种离子源的内能差异。

现定义Eion为母离子获得的总内能，Esou为离子源给母离子提供的内能，Etran为样品电离后母离子在离子传输过程中获得的内能，Ecol为母离子在CID过程中获得的能量，可得到式(1)。

Eion=Esou+Etran+Ecol

(1)

如果碰撞能量和传输过程的条件均保持一致，改变不同的电离源，则母离子在不同离子源中获得的总内能不同，它们之间的内能差异即为两个离子源给母离子提供内能的差异，列于式(2)。

(2)

(3)

结合式(2)和式(3)可得到式(4)。

(4)

厂商提供的碰撞能量与归一化碰撞能量之间的换算关系列于式(5)。

Eion=(settling NCE)×(isolation center)×

(charge factor)÷(500m/z)

(5)

其中，settling NCE为CE的设置值；isolation center为母离子的质荷比；charge factor为电荷因子，如果带单电荷，则取值为1。假设母离子为m/z500，那么当NCE设置值为20时，对应的能量是20×500/500×1=20 eV。

结合式(4)、(5)可得到式(6)。

ΔEion=(NCE2-NCE1)×(isolation center)×

(charge factor)÷500

(6)

2.2 罗丹明B的EESI-MS和ESI-MS分析

本实验分别搭建EESI-MS和ESI-MS装置平台，通过调控CID能量，对罗丹明B进行串联质谱分析。当碰撞能量为30%时，母离子m/z443主要丢失C2H4、C2H6和CO2中性分子，分别产生m/z415、m/z413和m/z399碎片离子。罗丹明B的EESI-MS2图和ESI-MS2图示于图1。对比图1a、1b可以发现，两种方法获得的碎片离子是一致的，但在ESI-MS中，碎片离子的相对丰度明显较EESI-MS中高，说明采用ESI对罗丹明B进行电离，准分子离子峰m/z443碎裂得更彻底，从而证明了EESI是一种比ESI更“软”的电离方式[17]。保持离子化条件和离子传输条件一致，仅改变离子阱中的碰撞能量，碎片离子峰强度会产生明显差异[18]。Shevchenko等[19]分别采用高能碰撞解离(HCD)和CID模式对磷脂类物质的裂解行为进行研究，发现在离子阱中HCD模式下比CID模式下产生的碎片离子丰度更强，这是由于HCD具有更高的能量，可进一步促使母离子裂解形成丰度更高的碎片离子。而在本实验中，采用ESI和EESI两种不同的电离方式，使离子传输条件与离子阱碰撞条件保持一致，得到的碎片离子丰度差异明显。两者谱图的差异是由于EESI与ESI传递给目标分子的内能存在差异。

注：a.EESI-MS2图；b.ESI-MS2图图1 碰撞能量为30%，罗丹明B的串联质谱图Fig.1 Tandem MS spectra of rhodamine B at the normalized collision energy of 30%

2.3 EESI与ESI传递给母离子内能差异的比较

在串联质谱中，增大碰撞能量能够加大母离子的碎裂程度。为了比较EESI与ESI之间能量的差异，在不同碰撞能量条件下对罗丹明B进行串联质谱实验，其母离子和碎片离子的峰强度与碰撞能量之间的关系示于图2a。可以看出，EESI-MS2与ESI-MS2中母离子与对应碎片离子随能量的变化趋势基本一致，但变化的幅度(斜率)、对应碎片离子的丰度行为差异较大。随着碰撞能量的升高，碎片离子的丰度逐渐增加，当碰撞能量过高时(>30%)，碎片离子无法在阱中稳定存在，导致碎片离子强度开始降低。通过拟合各曲线，得到ESI-MS2中碰撞能量在20%～40%之间时，母离子m/z443变化的斜率值(即对应能量增加的灵敏度)约为3 512；碰撞能量在20%～30%之间时，碎片离子m/z413变化的斜率值约为3 255，交点处的质谱图示于图1a。两者的斜率值相差不大，说明m/z443下降的斜率主要是生成m/z413。在EESI-MS2中，碰撞能量在15%～35%之间时，母离子m/z443变化的斜率值约为1 514；碰撞能量在15%～30%之间时，碎片离子m/z413变化的斜率值约为73，即m/z443下降的斜率较少部分是用来产生m/z413的。

母离子经过碰撞活化后，会发生分子内振动能量重新分布的现象，而且能量重排优于断裂反应。如果只考虑单键，则振动激发引起的断裂总是发生在能量最低的化学键，这使基于振动激发模型下的各种技术所产生碎片的形式仅依赖于母离子吸收能量的多少，而与能量接收方式无关[20]。这表明在相同实验条件下，在ESI-MS中有更多的能量作用在母离子上，驱使母离子碎裂形成更高强度的碎片离子。而引起这种现象的根源在于ESI与EESI离子源之间的内能存在一定的差异，这种差异直接表现在碎片离子的丰度变化上。

碎片离子与母离子峰强度比值同碰撞能量之间的关系示于图2b。可以看出，在EESI-MS2与ESI-MS2中，碎片离子与母离子峰强度比值随能量的变化趋势基本一致。在低碰撞能量(20%～30%)条件下，碎片离子与母离子峰强度比值缓慢上升；在高碰撞能量(30%～45%)条件下，碎片离子与母离子峰强度比值呈指数上升，母离子基本完全裂解，碎片离子强度快速升高。这是由于高碰撞能量使分子瞬间活化，加速了碎裂速率；而且在高能量碰撞条件下，离子运动剧烈，碎片离子无法在阱中稳定存在，导致部分离子排至阱外，或者继续分解成更小的碎片离子等，使其对ESI和EESI离子源内能差异的影响减弱。因此，高碰撞能量条件并不适用于计算离子源的内能差异。

注：a.m/z 413、m/z 415和m/z 443的强度与碰撞能量的关系；b.子离子与母离子强度的比值与碰撞能量的关系图2 在ESI-MS2和EESI-MS2条件下，离子强度的变化与碰撞能量的关系图Fig.2 Variation of ion intensities as a function of collision energy by ESI-MS2 and EESI-MS2

以碎片离子m/z413为例，采用2.1节方法计算两种离子源的内能差异。低碰撞能量(1%～21%)条件下，ESI-MS2和EESI-MS2中碎片离子m/z413绝对强度的变化趋势示于图3。在ESI-MS2中，当碰撞能量为1%时，碎片离子m/z413的强度为1，随着碰撞能量持续增大，m/z413的强度缓慢增加，当能量为13%时出现拐点，随后m/z413的强度呈指数快速增加，示于图3a。这可能是由于罗丹明B分子中的共轭体系很大，且具有刚性平面结构，低碰撞能量过程中传递给罗丹明B分子的能量大部分用于降低分子共轭体系的能量，小部分用来解离形成碎片，当碰撞能量增大到一定值(远大于分子的键解离能)时，碎片离子的强度显著增加，此时的能量主要用于形成碎片离子。在EESI-MS2中，当碰撞能量小于14%时，罗丹明B分子未被活化，碎片离子m/z413的强度均为0，要使碎片离子m/z413的峰强度达到1，碰撞能量至少为14%，即使ESI-MS2和EESI-MS2中碎片离子m/z413的强度相同(均为1)，两者串联质谱中的碰撞能量之差为13%。结合2.1节的计算式可知，13%的碰撞能量即为两种离子源的内能差。由式(6)可计算出两种离子源的内能差值为11.5 eV。

注：a.ESI-MS2；b.EESI-MS2图3 m/z 413的强度与碰撞能量从1%～21%变化的关系图Fig.3 Variation of m/z 413 intensities as a function of collision energy of 1%-21%

2.4 方法的适用性

为了提高该方法测量的准确性，选择其他碎片离子(如m/z415、m/z399等)来测定内能差异。在ESI-MS2中，当碰撞能量为1%时，碎片离子m/z415的强度为0.4；在EESI-MS2中，要使碎片离子m/z415的峰强度达到0.4，碰撞能量至少为14%，即两种离子源的内能差为13%的碰撞能量。由式(6)计算两种电离源内能差值为11.5 eV。采用该方法对碎片离子m/z399的强度变化进行计算，得到的结果与上述一致，由此验证了该方法计算内能差异的可靠性。

3 结论

本研究采用质谱中离子丰度行为差异对EESI和ESI两种软电离技术的内能差异进行实验测定，其测定值为11.5 eV。该方法原理简单、操作简便、无需繁杂的计算过程，不仅可为不同离子源内能差异的比较提供参考依据，也可为深刻理解不同离子源产生离子的质谱行为提供参考。