基于质谱技术的黄芩治疗2型糖尿病的粪便代谢组学研究

周 元，张沐新，张亚楠，刘志强，宋凤瑞，赵春芳

(1.吉林大学药学院，吉林 长春 130021；2.中国科学院长春应用化学研究所，吉林 长春 130022)

糖尿病是由胰岛素分泌缺乏或胰岛素生物效应降低引起的以血糖水平增高为特征的代谢性疾病[1-4]。临床上以2型糖尿病患者最多，占总患病人数的90%以上[5-6]。中药对改善机体状况、减轻发病症状，尤其在治疗糖尿病并发症方面有着稳定的疗效[7-8]。黄芩为唇形科植物黄芩(ScutellariabailensisGeorgi)的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血等功效[9]，其主要活性成分为黄酮类化合物，如黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素[10-11]。有研究表明[12-13]，黄芩具有调节血糖、血脂以及抗氧化等作用。但关于黄芩治疗2型糖尿病的整体作用机制尚无报道。

代谢组学以生物体内源性代谢物小分子作为研究对象，通过多指标综合分析，研究代谢物种类含量变化规律，以此揭示生物体的代谢活动[14-15]。目前，代谢组学发展迅速，并广泛应用于药物研发、药物治疗和毒性评价等领域[16]。以粪便为检测对象的代谢组学研究常见于有关肝脏、肠道等疾病研究[17-18]，用以观测肝脏及肠道参与的机体代谢变化。糖尿病作为一种长期代谢性疾病，其肝脏病变及肠道菌群变化也常见报道[19-20]。

本研究拟应用粪便代谢组学研究方法，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF MS)分别检测健康对照组、2型糖尿病模型组和黄芩治疗组的大鼠粪便，并通过主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)寻找与黄芩治疗作用相关的潜在生物标志物，通过分析这些生物标志物含量的变化，探索黄芩治疗2型糖尿病的作用机制。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Acquity UPLC液相色谱仪、Q-TOF Synapt G2 HDMS 质谱仪：美国Waters公司产品；Centrifuge 5810R 型冷冻离心机：德国Eppendorf公司产品；Milli-Q Gradient A10超纯水系统：美国Millipore公司产品。

黄芩：购于同仁堂长春分店，由长春中医药大学药学院鉴定；链脲佐菌素：美国Sigma公司产品；乙腈、甲醇：色谱纯，美国Tedia公司产品。

1.2 黄芩提取物的制备

称取适量的黄芩药材粗粉，以8倍量60%乙醇加热回流提取2次，合并提取液并旋转蒸发至近干后冻干，得到黄芩提取物粉末，备用。

1.3 疾病模型建立与药物治疗

1.3.1建模准备 选择50只雄性SD大鼠，初始质量为200～240 g，由吉林大学实验动物中心提供。将链脲佐菌素溶液溶于pH 4.5的0.1%柠檬酸缓冲液中，现用现配。

脂肪乳的配制：取40 g猪油、5 g胆固醇、1 g甲基硫氧嘧啶、40 mL吐温80，充分混匀后得到油相。以1 g谷氨酸钠、5 g蔗糖、5 g果糖、60 mL蒸馏水、60 mL 1,2-丙二醇，充分溶解混匀得到水相。将油相与水相充分混合，即得脂肪乳，于4 ℃冰箱中保存，使用时加热溶解。

1.3.2建模方法 对大鼠脂肪乳连续灌胃20 天，灌胃剂量为0.1 mL/kg，然后以35 mg/kg的剂量腹腔注射新配的链脲佐菌素溶液。一周后，剪尾取血测定大鼠血糖值(检测前禁食过夜)，大于16.7 mmol/L则建模成功。取15只建模成功大鼠，标准饲料喂养12周，为糖尿病模型组(模型组，TM)。另取15只建模成功大鼠，以3 g/kg黄芩提取物给药量给药12周，为黄芩治疗组(黄芩组，RS)。健康对照组(HC)为正常大鼠，标准饲料喂养12 周，共15只。

1.4 样品收集及制备

实验第12周时，收集各组大鼠粪便，加入3倍量甲醇溶液，涡旋混匀5 min后，以5 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm 有机滤膜，待UPLC-Q-TOF MS检测。

1.5 实验条件

1.5.1色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)；色谱柱温度：40 ℃；进样量：5 μL；流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液；流速：0.3 mL/min；梯度洗脱条件：0～1 min(5%～30%A)，1～3 min(30%～50%A)，3～3.6 min(50%～53%A)，3.6～4.2 min(53%～60%A)，4.2～6 min(60%～80%A)，6～8 min(80%～100%A)，8～9 min(100%A)。

1.5.2质谱条件 电喷雾(ESI)离子源；离子源温度120 ℃；质量扫描范围m/z100～1 000；锥孔气和去溶剂气均为氮气，流速分别为50 L/h和700 L/h，其中去溶剂气温度为350 ℃。正离子模式下毛细管电压为3.0 kV，负离子模式下毛细管电压为2.0 kV；正、负离子模式下锥孔电压和提取锥孔电压均分别为40 V和5.0 V。利用甲酸钠建立质量标准曲线，亮氨酸脑啡肽(LE)进行实时质量校正；以氩气作为碰撞气进行MS/MS分析，低碰撞能为5 eV，高碰撞能为10～25 eV。

1.6 数据处理

采用UPLC-Q-TOF MS 检测样品，将原始数据以 MassLynx V4.1 和 MarkerLynx Application Manager进行峰检测、峰对齐、峰强度校正等，并将结果以精确分子质量、保留时间、归一化后的峰面积建立数据矩阵。使用EZinfo 2.0软件中的PCA和OPLS-DA对数据矩阵进行多元变量分析。使用PASW Statistics 18.0软件进行t检验，通过变量重要性因子(VIP)比较组间差异。并通过检索HMDB(http:∥www.hmdb.ca/)，KEGG(http:∥www.kegg.com/)等生物学数据库鉴定生物标志物，分析生物标志物在各组中的含量。

1.7 体重与空腹血糖检测

分别在给药之前(0周)，给药第4、8、12周后对糖尿病模型组、黄芩治疗组和健康对照组大鼠进行剪尾取血测血糖(检测血糖前禁食过夜)，并称量大鼠质量。

2 结果与讨论

2.1 体重与空腹血糖检测结果

体重与空腹血糖是观测糖尿病患者身体状况的基础指标，二者随时间变化的结果分别列于表1、表2。在治疗的12周过程中，黄芩组大鼠体重下滑趋势相比模型组较为缓慢，第12周两组大鼠的体重呈现显著性差异(P<0.05)。

表1 各组大鼠体重(平均值±SD，n=8)Table 1 Weight of rats in each group (Means±SD, n=8)

注：*表示与模型组相比P<0.05；**表示与模型组相比P<0.01

表2 各组大鼠血糖(平均值±SD，n=8)Table 2 Blood glucose of rats in each group (Means±SD, n=8)

注：*表示与模型组相比P<0.05；**表示与模型组相比P<0.01

结果表明，黄芩对2型糖尿病大鼠体重下降有一定抑制作用。血糖检测结果与体重检测结果类似，黄芩组大鼠空腹血糖增长趋势相比模型组较为缓慢，第12周两组大鼠的血糖呈显著性差异(P<0.01)。综上，体重和空腹血糖检测结果表明，黄芩对于糖尿病大鼠的健康状况有一定的改善作用，且随着治疗时间延长，作用更加明显。

2.2 粪便代谢物谱分析及潜在生物标志物鉴定

处理后的粪便样品经UPLC-Q-TOF MS分离和检测，结果导入MassLynx V4.1软件，运用代谢组学方法进行分析。对数据进行PCA分析，正、负离子模式下的PCA得分图示于图1。PCA得分图中每个点的位置代表某一样品的成分和含量，点的位置越接近，样品的成分含量越接近。图1中，健康对照组、模型组和黄芩组的PCA得分点表现出明显的区分，表明模型组和黄芩组的大鼠粪便代谢物图谱相对于健康对照组有明显的变化。

通过OPLS-DA分析法进一步区分模型组和黄芩治疗组的组间差异。正、负离子模式下的OPLS-DA得分图示于图2。由图可以看出，在两种离子模式下，模型组和黄芩组均有明显的区分，表明黄芩给药12周后，2型糖尿病大鼠的粪便代谢有了明显的改变。

注：■——健康对照组；◆——模型组；▲——黄芩组图1 正(a)、负(b)离子模式下的PCA得分图Fig.1 PCA score plots at positive (a) and negative (b) ion mode

通过分析OPLS-DA模型下的S-plot图，寻找组间差异明显的代谢物。正、负离子模式下的S-plot图示于图3。其中，“S”型图形由每个代谢物点构成，位于“S”两端的点为区分模型组和黄芩组大鼠贡献较大的代谢物。选择VIP值大于1的代谢物，通过质荷比和串联质谱数据，并结合搜索数据库，共鉴定出11种化合物，即黄芩治疗2型糖尿病大鼠的潜在生物标志物。

注：◆ ——模型组；▲—— 黄芩组图2 正(a)、负(b)离子模式下的OPLS-DA得分图Fig.2 OPLS-DA score plots at positive (a) and negative (b) ion mode

2.3 黄芩治疗2型糖尿病作用机制分析

正、负离子模式下，11种生物标志物的基本信息及在各组中的含量变化列于表3，11种生物标志物在各组中的相对含量信息示于图4。通过分析模型组与健康对照组的标志物含量的变化趋势，以及黄芩组相对于模型组对标志物含量的调节作用，可阐明黄芩对各代谢通路的调节作用。

图3 正(a)、负(b)离子模式下，模型组和黄芩组的S-plot图Fig.3 S-plot of OPLS-DA at positive (a) and negative (b) ion mode

鞘氨醇、加鞘氨醇和植物鞘氨醇均与机体鞘脂类代谢通路有关，鞘脂类代谢产物通常为脂质信号分子，可以影响细胞增殖、分化、凋亡等过程。有研究表明[21]，鞘脂类代谢异常与胰岛素抵抗等多种慢性疾病密切相关。鞘氨醇是一种氨基醇，在体内可以衍生形成加鞘氨醇。加鞘氨醇是一种磷脂，在体内可以抑制胆固醇的运转，并通过抑制低密度脂蛋白而抑制胆固醇酯化反应。鞘氨醇和加鞘氨醇是哺乳动物鞘脂类的主要物质基础。由表3可以看出，黄芩对于这3种生物标志物的含量调节作用均与疾病的恶化趋势相反，说明黄芩对鞘脂类代谢通路具有调节作用。

表3 黄芩治疗2型糖尿病的潜在生物标志物Table 3 Potential biomarkers of Radix Scutellariae treated for type 2 diabetes

图4 生物标志物在健康组、模型组和黄芩组中相对含量图(*表示与模型组相比，P<0.01)Fig.4 Relative intensities of biomarkers from HC, DM and RS (*P<0.01, compared to DM)

三羟基三甲基吲哚酮是三甲基吲哚代谢过程中形成的产物。色氨酸代谢形成三甲基吲哚后，由肠道细菌进一步氧化形成三羟基三甲基吲哚酮，因此，该化合物与色氨酸代谢通路相关。表3显示，黄芩对该标志物的含量具有调节作用，说明黄芩可通过影响肠道菌群而影响色氨酸的代谢。

脂肪酸代谢异常与糖尿病密切相关[22]，苯丙酸甲酯、二十四酰基甘氨酸、亚麻油酸均是与脂肪酸代谢相关的生物标志物。苯丙酸甲酯是一种脂肪酸酯，是脂肪酸的羧酸酯衍生物，多存在于粪便中。二十四酰基甘氨酸是一种常见的氨基乙酸，是脂肪酸的代谢产物，常与脂肪酸氧化功能障碍有关。亚麻油酸与脂质体的转运和代谢相关，位于亚麻油酸的代谢通路中。由表3可以看出，黄芩对这3种标志物均有正向调节作用，据此推断黄芩对脂肪酸的代谢具有调节作用。

白三烯E4是一种半胱氨酰白三烯，是炎症介质家族中的一类化合物，位于花生四烯酸代谢通路中，白三烯E4水平的升高被认为与炎症的发生有关。表3中显示，模型组与健康对照组的白三烯E4水平升高，说明2型糖尿病会导致机体炎症的发生，而黄芩治疗组中白三烯E4水平下降，可见黄芩对机体炎症的发生具有抑制作用。

亮氨酰脯氨酸属于多肽类物质，它由2个氨基酸结合衍生而成，在机体中常产生较大蛋白质的降解。黄芩对于亮氨酰脯氨酸的含量变化具有调节作用。

雌二醇是一种雌激素类固醇，属于内源性抗氧化剂，具有抑制肝脏纤维化等功能。机体内可由芳香化酶将睾酮转化成雌二醇。雌二醇处于机体甾类激素生物合成途径中，黄芩对雌二醇的含量具有正向调节作用。

3 结论

本研究采用基于UPLC-Q-TOF MS的粪便代谢组学方法，研究了黄芩治疗2型糖尿病大鼠的粪便代谢谱变化，并监测了大鼠体重及空腹血糖随时间的变化情况。结果表明，黄芩对2型糖尿病大鼠的鞘脂类代谢及脂肪酸代谢具有治疗作用，同时对于三羟基三甲基吲哚酮、白三烯E4、亮氨酰脯氨酸和雌二醇的含量具有调节作用，并且，黄芩对于大鼠体重的减少和空腹血糖的增加具有一定的控制作用。