细胞膜固相色谱法筛查奶粉中AGEs特异结合成分

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(1.南京市产品质量监督检验院,江苏南京 210028;2.中国药科大学中药学院,江苏南京 211198)

食品中的晚期糖基化终产物(advanced glycosylation end products,AGEs)是还原糖和蛋白质、脂肪等通过美拉德反应形成的一类稳定的产物[1],常见于咖啡、可乐、巧克力、麦芽制品、浓缩乳或经热加工的乳制品以及肉类制品等食物中,其含量受加工方式、加工温度、加工时间及其蛋白质、脂肪、碳水化合物、水分含量的共同影响[2-4]。通过膳食摄入进入体内的过量AGEs具有一定的危害性,可能诱发糖尿病、肾脏疾病、心血管疾病、免疫缺陷、衰老、炎症等多种疾病[5-6]。AGEs中的成分如羧甲基赖氨酸(carboxymethyl-lysine,CML)、羧乙基赖氨酸(carboxyethyl-lysine,CEL)和吡咯素(pyralline,Pyr)、戊糖苷素、交联素等已被认为是食品中潜在的有害因子[7]。AGEs的种类繁多,当前食品中AGEs的种类和含量国内报道较少,国内外相关检测也仅限于以下两类AGEs检测方法[8-9]:免疫学检测法(ELISA法)与仪器检测法。

细胞膜固相色谱技术是在生命科学和色谱分离技术基础上交叉形成的一种新兴的色谱技术,利用具有亲和作用的生物大分子,研究与化学成分间特异性的结合与分离[10]。目前,已广泛应用于复杂体系中活性成分的筛选[11]。血管内皮细胞上存在很多AGEs特异结合位点,即RAGE受体。AGEs与RAGE结合后,启动多种信号转导途径,如炎症反应、凋亡反应等,诱导细胞因子的合成与释放,促进血管内皮功能紊乱,进而引起多种疾病的发生发展[12]。这些病理改变与多种AGEs成分和细胞膜上受体相互作用有关,这为将细胞膜固相色谱技术应用到食品体系中AGEs成分的筛查提供了理论依据。本课题组前期采用人脐静脉内皮细胞与AGEs交联成分MG-H1共同孵育,通过解离技术和现代色谱HPLC-DAD方法,检测到AGEs成分MG-H1与细胞膜上受体特异性结合,结合率随孵育时间的延长而增加[13]。

牛奶是最早在食品体系中发现食源性AGEs存在的食品[14],而奶粉的生产过程中需要真空加热干燥,在这个过程中,由于牛奶受热易发生美拉德反应,近年来研究发现奶粉中含有AGEs成分[15-17]。因此,本文以含晚期糖基化终产物食品奶粉为研究对象,借助细胞膜固相色谱技术和HPLC-MS/MS技术筛查奶粉中AGEs特异性成分,建立快速检测此类特异性化学成分的分析方法,以期为奶粉中AGEs的监测和控制提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

氢氧化钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氨水、乙醇 分析纯,南京化学试剂股份有限公司;正己烷、十水合四硼酸钠、硼氢化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;盐酸 分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司;柠檬酸 分析纯,广东汕头市西陇化工厂;甲醇、乙腈、三氟乙酸 色谱纯,美国TEDIA公司;实验室用水 Milli-Q超纯水;DMEM低糖培养基、胰蛋白酶(酶活2.5×103U/mg) 江苏凯基生物技术股份有限公司;胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司;奶粉 3种不同厂家，南京市当地超市;CML标准品(纯度98%,CAS号5746-04-3)、CEL标准品(纯度96%,CAS号5746-03-2)、Pyr标准品(纯度98%,CAS号74509-14-1) 加拿大TRC公司。

Agilent 6495 LC/MS/MS液相色谱质谱联用仪、Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)液相色谱柱 美国安捷伦公司;Strata-X-C固相萃取柱 美国phenomenex公司;UGC-24M氮吹仪 北京优晟联合科技有限公司;XB-80A涡旋振荡器 海门其林贝尔有限公司;Milli-Q纯水机 美国Millipore 公司;Allegra 64R台式高速冷冻离心机 美国Beckman公司;Anke TDL-40B型低速大容量多管离心机 上海安亭科学仪器厂;150i全能型CO2培养箱 Thermo Electrom公司;二级生物安全柜 美国Labconco公司;LDZX-50KB立式压力蒸气灭菌器 上海申安医疗器械厂;HH-60数显恒温搅拌循环水浴锅 国华电器有限责任公司;微量移液器 美国Thermo公司;XDS-1B倒置显微镜 重庆光电仪器总公司;Mettler AL204十万分之一天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;人脐静脉内皮细胞 江苏凯基生物技术股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 根据Hegele和Assar等[18-19]的方法,并稍作修改,对奶粉样品进行前处理。称取1 g奶粉样品置于50 mL带盖耐热试管中,加入10 mL正己烷,充分涡旋1 min,4000 r/min离心10 min,弃去正己烷层,重复上述正己烷脱脂过程3次,40 ℃氮吹至完全挥干正己烷。脱脂后,将样品中加入10 mL硼酸钠缓冲液(0.2 mol/L,pH9.2),涡旋混匀后,加入1 mL硼氢化钠溶液(2 mol/L,用0.1 mol/L氢氧化钠配制),混匀后4 ℃冰箱放置8 h 进行还原反应。根据Folch等[20]方法,还原反应结束后加入8 mL三氯甲烷-甲醇(2∶1,V∶V)使蛋白质沉淀,于5000 r/min离心10 min后,弃去上清液。在沉淀物中加入8 mL 6 mol/L的盐酸溶液,置于110 ℃烘箱中,酸解24 h。将酸解样品取出并冷却至室温,用氮气将酸解液吹干,用超纯水再溶解后定容至50 mL,然后用滤纸过滤并收集滤液。分别依次用3 mL甲醇和3 mL水洗净和活化Strata-X-C固相萃取柱(流速为1 mL/min),取上述滤液过柱,依次用3 mL水和3 mL甲醇洗净杂质后(流速为0.5 mL/min),用5 mL含体积分数5%氨水的甲醇溶液洗脱(流速为0.5 mL/min),收集的洗脱液经氮吹浓缩至干。

1.2.2 溶液的配制 PBS溶液的配制:氯化钠:8.0 g;氯化钾:0.2 g;磷酸氢二钠:3.49 g;磷酸二氢钾:0.2966 g。将上述试剂置于烧杯中,加入蒸馏水,玻璃棒搅拌,超声,至充分溶解,定容至1 L,高温高压灭菌(121 ℃,103 kPa)后,分装后于4 ℃冰箱保存。

奶粉AGEs提取液:取5 mg 1.2.1中固相萃取浓缩后的样品,溶解于5 mL PBS溶液中,经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,备用。

解离液:10.948 g磷酸氢二钠,12.911 g柠檬酸,配成1 L溶液,过0.22 μm微孔滤膜,备用。

1.2.3 细胞的培养 复苏:取保存在液氮中的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),立即放入37 ℃水浴中,振摇,溶化后装入15 mL离心管中,加入含100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清的不完全DMEM(低糖)培养基10 mL,37 ℃、2000 r/min下离心2 min,吸去培养基。取得到的细胞悬液,加入75 cm2培养瓶中,另加入4 mL培养基,于37 ℃、5% CO2、95% O2培养箱中孵育。

换液:每隔24 h换一次培养基,吸去原培养基,加入5 mL新培养基,于37 ℃、5% CO2、95% O2条件下孵育。

传代:细胞长至约90%融合度后,对细胞进行传代,吸弃原培养基,PBS溶液(pH=7.4)润洗2～3次,加入0.25%的胰酶1 mL,消化2 min后,加入新培养基洗涤细胞,转移至15 mL离心管中,2000 r/min下离心2 min,吸弃培养基,再加入1 mL新培养基,移液枪吹打均匀,使用细胞计数板进行细胞计数。取0.5 mL细胞悬液,加入75 cm2培养瓶中,另加入10 mL培养基,于37 ℃、5% CO2、95% O2条件下孵育。

1.2.4 细胞膜固相方法 细胞膜固相化奶粉中AGEs特异结合成分:取1.2.3传代后长满的大瓶细胞,使其贴壁正常生长,除去培养基,加入奶粉AGEs提取液,于37 ℃、5% CO2、95% O2条件下孵育60 min,取出孵育液,待测。

未结合成分的洗脱:用PBS洗涤细胞,弃去上清,反复洗涤,取最后一次PBS洗涤液,待测。

细胞膜固相化的奶粉中AGEs特异结合成分解离:贴壁细胞随即加入解离液,于37 ℃、5% CO2、95% O2条件下孵育30 min,使细胞效应靶点失活,上清液为活性成分解离液,取出,待测。

检测样品的制备:取上述所得最后一次PBS洗涤液、内皮细胞膜解离液,另取空白解离液作为对照,所有样品氮气吹干。各样品中加入0.8 mL甲醇,涡旋2 min,使其充分溶解,再次氮气吹干。加入0.2 mL甲醇复溶,涡旋2 min,11000 r/min离心10 min。取上清过0.22 μm有机相滤膜,进行HPLC-MS/MS检测。

1.2.5 HPLC-MS/MS鉴定奶粉中AGEs特异结合成分 色谱条件:Agilent ZORBAX SB C18液相色谱柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm);进样量10 μL;流速为0.5 mL/min;柱温:30 ℃;流动相A为含有5 mmol/L三氟乙酸的高纯水,流动相B为含有5 mmol/L三氟乙酸的乙腈,梯度洗脱条件:0～3 min,A:95%～88%;3～12 min,A为88%;12～25 min,A:88%～55%;25～26 min,55%～95%;26～30 min,A:95%～95%。

质谱条件:电喷雾离子源(ESI);正离子扫描模式;多反应监测模式(MRM);驻留时间:500 ms;离子源温度:200 ℃;脱溶剂温度:380 ℃;脱溶剂气流速:500 L/h;锥孔气流速 50 L/h;进样锥电压20 V;毛细管电压:3 kV;脱溶剂气和锥孔气为氮气,碰撞气体为氩气。

1.2.6 HPLC-MS/MS测定奶粉中AGEs主要成分含量 采集市场上销售的三种厂家奶粉样品,同1.2.1样品前处理,收集的洗脱液经氮吹浓缩后,复溶于1 mL初始流动相溶液中,过0.22 μm微孔滤膜后,用于HPLC-MS/MS分析。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 细胞膜固相色谱筛查出奶粉中AGEs特异结合成分鉴定结果

本实验采用奶粉AGEs提取液与人脐静脉内皮细胞共孵育60 min,PBS洗涤,排除未与细胞膜靶点结合的非活性成分后,加入解离液,使细胞膜靶点失活,解离人脐静脉内皮细胞膜上被结合的活性成分,HPLC-MS/MS对解离液进行分析。发现PBS最后洗涤液与空白解离液均没有色谱峰出现,孵育后的解离液有3个色谱峰(图1)。结果表明,有3个成分为细胞膜固相活性产物,这3个物质可能是奶粉中AGEs主要成分。

图1 细胞膜固相产物图谱Fig.1 Chromatogram of the cell membrane immobilized incubation注:A.内皮细胞膜解离液;B. PBS最后洗涤液;C.空白解离液。

3个AGEs主要成分的质谱图如图2～图4。结合食品中已发现的AGEs化学成分的文献,综合分析各化合物的色谱保留时间、相对分子质量、碎片离子信息以及相关文献数据,推测确定了3个化合物,分别为羧甲基赖氨酸(carboxymethyl-lysine,CML)、羧乙基赖氨酸(carboxyethyl-lysine,CEL)和吡咯素(pyralline,Pyr),见表1,结构式见图5。在正离子模式下,化合物1产生m/z 205分子离子峰,丢失甘氨酸(75)产生碎片离子m/z 130,继而丢失甲酸(46)产生碎片离子m/z 84,结合文献[21],推断化合物1为羧甲基赖氨酸。化合物2也表现出与化合物1类似的裂解行为,故参照化合物1的推导方法,结合文献,推断化合物2为羧乙基赖氨酸[21]。化合物3产生 m/z 255分子离子峰,丢失1分子H2O产生碎片离子m/z 237,再丢失1分子H2O产生碎片离子m/z 219,继而丢失1分子CO2产生碎片离子m/z 175,再分别丢失1分子氨气(17)和1分子氰化氢(27),产生碎片离子m/z 158和m/z 148,结合文献[22]推断化合物3为吡咯素。

表1 HPLC-MS/MS检测HUVEC细胞共孵育后3个成分特征碎片Table 1 Characterizations of 3 components after incubation with HUVEC cells by HPLC-MS/MS

图2 细胞膜固相产物1的MS解析谱图Fig.2 MS/MS fragments of compound 1

图3 细胞膜固相产物2的MS解析谱图Fig.3 MS/MS fragments of compound 2

图4 细胞膜固相产物3的MS解析谱图Fig.4 MS/MS fragments of compound 3

图5 细胞膜固相产物的结构式Fig.5 The structures of 3 components after incubation with HUVEC cells

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系、检出限和定量限 分别配制质量浓度为10、50、100、200、400、800 ng/mL的CML、CEL和Pyr混合标准溶液,进行HPLC-MS/MS检测。以对照品进样质量浓度为横坐标(X),对照品色谱峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得到各物质的线性回归方程,并对检出限和定量限进行验证。CML线性回归方程为Y=75.19X+1444.57,R2=0.9999,CEL线性回归方程为Y=121.30X+2019.26,R2=0.9998,Pyr线性回归方程为Y=27.71X+458.61,R2=0.9992。CML、CEL和Pyr的线性范围为10～800 ng/mL,相关系数R2均在0.999以上,线性关系良好。分别以信噪比(S/N)=3和信噪比(S/N)=10,得到仪器的检出限(LOD)和定量限(LOQ)。CML、CEL检出限为1 ng/mL,定量限为5 ng/mL;Pyr检出限为3 ng/mL,定量限为7 ng/mL。表明该方法具有较高的灵敏度。

2.2.2 加标回收率与精密度 向奶粉酸解液中加入CML、CEL、Pyr标准溶液,分别设置高、中、低三个加标量,使加标量分别为50、100、200 ng/mL。由于未加标样品含有一定量的CML、CEL、Pyr(即本底值),因此对未加标样品和加标样品均进行HPLC-MS/MS法分析测定,加标回收率(%)=(实测值-本底值)/加标量×100,每个加标量平行测定6次(n=6)。结果见表2,该方法对CML的回收率为93.02%～100.95%之间,相对标准偏差(RSD)为3.62%～5.80%;对CEL的回收率为93.80%～102.62%之间,RSD为2.34～8.97%;对Pyr的回收率为92.38%～100.71%,RSD为1.41%～4.32%。可见该方法对CML、CEL和Pyr均具有良好的回收率和精密度,适合于奶粉类样品检测。

表2 CML、CEL和Pyr加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs ofCML,CEL and Pyr(n=6)

2.3 奶粉中CML、CEL和Pyr含量的测定

采集市场上销售的三种厂家的奶粉样品,根据细胞膜固相筛查出的奶粉中主要AGEs成分和已经建立的HPLC-MS/MS方法,对三种不同厂家奶粉中CML、CEL和Pyr含量进行测定,每个样品平行测定3次(n=3),结果见表3。三种厂家奶粉样品CML、CEL和Pyr均有检出,几乎所有样品中Pyr含量最高,其含量范围为84.56～97.36 mg/(kg样品);其次是CML,其含量范围为23.38～32.68 mg/(kg样品);CEL含量最少;其含量范围为12.67～19.76 mg/(kg样品)。由表中数据可以看出,不同来源的奶粉样品中AGEs成分含量有所差异。奶粉的加工过程中需要进行真空干燥,不同的加热温度与加热时长会使得奶粉生产加工过程中美拉德反应的程度不同,因此晚期糖基化终产物生成量可能不同,致使不同厂家奶粉中CML、CEL和Pyr含量有所差异。

表3 奶粉中结合态CML、CEL和Pyr含量(n=3)Table 3 Contents of protein-bound CML,CEL and Pyr in milk powder(n=3)

3 结论

本研究通过对奶粉AGEs提取液与血管内皮细胞固相化,发现奶粉中有3个物质为细胞膜固相活性产物,经鉴定,这些物质分别是CML、CEL和Pyr,从而明确了奶粉中主要AGEs成分。利用建立的HPLC-MS/MS方法检测奶粉中CML、CEL和Pyr含量,CML、CEL检出限为1 ng/mL,定量限为5 ng/mL,Pyr检出限为3 ng/mL,定量限为7 ng/mL。该方法对CML的回收率为93.02%～100.95%之间,相对标准偏差(RSD)为3.62%～5.80%;对CEL的回收率为93.80%～102.62%之间,RSD为2.34～8.97%;对Pyr的回收率为92.38%～100.71%,RSD为1.41%～4.32%。通过对三种厂家的奶粉样品CML、CEL和Pyr含量进行测定,发现奶粉AGEs成分中Pyr含量最高,其次为CML,CEL含量最低。建立的细胞膜固相色谱法联合HPLC-MS/MS法成功地应用于奶粉中AGEs成分的筛查,具有操作简便、快速、特异性好等特点。因此,将细胞膜固相色谱技术首创性地引入到食品体系中AGEs成分的筛查,能有效的实施食品中具有潜在危害作用的AGEs成分快速检出,实现对食品直观有效的质量控制,具有重要的借鉴意义。