天山雪莲提取物固体脂质纳米粒的制备及其有效成分芦丁和绿原酸在Caco—2细胞中的摄取

刘桂花 刘宣麟 谭梅娥 何承辉

摘要：目的 制备天山雪莲提取物（SIHE）的固体脂质纳米粒（SLNs），并对其形态、粒径、电位、包封率及稳定性等进行考察；考察SIHE-SLNs和SIHE中芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取。方法 采用HPLC建立蘆丁和绿原酸的含量测定方法。采用高压匀质法制备SIHE-SLNs。采用CCK-8法测定SIHE对Caco-2细胞存活率的影响。建立Caco-2细胞模型，进行SIHE-SLNs和SIHE中有效成分芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取。结果 制备的SIHE-SLNs具有较小的粒径和较高的包封率。SIHE浓度低于250 ?g/mL对Caco-2细胞无细胞毒性。SIHE-SLNs及SIHE中芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取量随药物浓度和药物作用时间的增加而增加，SIHE-SLNs中的摄取量高于SIHE；抑制剂维拉帕米对SIHE-SLNs和SIHE中绿原酸的作用均随浓度的增加而降低，对SIHE中两成分的降低效果更显著；底物根皮苷可以同时竞争性抑制SIHE-SLNs和SIHE中芦丁的摄取，但对绿原酸影响不大。结论 本研究制备了质量良好的SIHE-SLNs。SIHE-SLNs和SIHE中芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取受浓度、时间和P-糖蛋白抑制剂及底物的影响。

关键词：天山雪莲提取物固体脂质纳米粒；芦丁；绿原酸；Caco-2细胞；P-糖蛋白

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.12.019

中图分类号：R283.5；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）12-0076-07

Abstract： Objective To prepare Saussureae Involucaratae Herba extracts （SIHE） loaded solid lipid nanoparticles （SLNs）； To inspect the shape， particle size， potential， encapsulation efficiency and stability of SIHE-SLNs； To inspect uptake of rutin and chlorogenic acid of SIHE-SLNs and SIHE in Caco-2 cells. Methods The method for determination of rutin and chlorogenic acid was established by HPLC. SIHE-SLNs were prepared by high pressure homogenization. The effects of SIHE on the survival rate of Caco-2 cells were determined by CCK-8 method. Caco-2 cell model was established， and uptake test of rutin and chlorogenic acid in Caco-2 cells was carried out. Results Prepared SIHE-SLNs had a smaller particles size and higher entrapment efficiency. SIHE had no cytotoxicity to Caco-2 cells in the dose of 250 ?g/mL. The uptake of rutin and chlorogenic acid in Caco-2 cells of SIHE-SLNs and SIHE increased with increase of drug concentration and action time， while the absorption of SIHE-SLNs was higher than that of SIHE. The effects of verapamil on chlorogenic acid in SIHE-SLNs and SIHE decreased with increase of drug concentration and was more remarkable in SIHE. The substrate phloridzin could simultaneously competitively inhibit the uptake of rutin in SIHE-SLNs and SIHE， but had no effect on chlorogenic acid. Conclusion SIHE-SLNs prepared in this study have good quality. Uptake of rutin and chlorogenic acid in Caco-2 cells of SIHE-SLNs and SIHE are influenced by concentration， time， P-glycoprotein inhibitor and substrate.

Keywords： Saussureae Involucratae Herba extract loaded solid lipid nanoparticles； rutin； chlorogenic acid； Caco-2 cells； P-glycoprotein

天山雪莲为菊科植物天山雪莲Saussurea involucrata（Kar. et Kir.）Sch.-Bip.的地上部分，是维吾尔民族常用药[1-2]。天山雪莲具有散寒除湿、活血通经、抗炎镇痛、收缩子宫的功效，主要用于各种风湿性关节病、风寒湿痛、月经不调等。研究表明，天山雪莲含有黄酮类、苯丙素类、多糖、生物碱和内酯等成分，具有抗氧化、抗炎、抗疲劳和抗脑缺血/再灌注损伤等药理作用[3-5]。前期研究表明，芦丁和绿原酸是天山雪莲提取物（SIHE）的主要有效成分[6-7]，但因其溶解性较差，口服吸收效果差，生物利用度低，限制了其临床使用[8]。

固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles，SLNs）是20世纪90年代发展起来的一种纳米给药载体，是由可生物降解的固体脂质为载体，将药物包裹于其中制备而成[9-10]。SLNs具有高包封率，低毒或几乎无毒，可有效提高药物的生物利用度，同时能够提高不稳定药物的稳定性，良好的脂溶性使其具有缓控释及靶向作用[11-13]。此外，SLNs具有多种制备方法及给药途径[14]，目前已用于多种药物制剂的研究。

Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞，其结构和功能类似于人小肠上皮细胞，体外培养一段时间后能分化出小肠微绒毛结构，并含有与小肠刷状缘上皮相似的酶系[15-16]。Caco-2细胞模型可以在细胞水平提供关于药物在小肠中的过程，被广泛运用于药物口服机制的考察，研究药物在小肠的摄取、代谢、转运和排泄等过程，及P-糖蛋白介导的多药耐药性（MDR）[17-19]。近年来，随着药学研究的发展，Caco-2细胞模型在中药研究中的应用越来越广泛[20]。

本研究采用高压匀质法制备SIHE-SLNs，并通过Caco-2细胞模型研究SIHE-SLNs及SIHE中有效成分芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取，为后续研究提供基础。

1 仪器与试药

ME104型电子天平（美国梅特勒-托利多仪器有限公司），Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），NS1001L Panda2K型高压匀质机（意大利Niro Soavi），DZKW-S-A型电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂），KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Millipore超滤离心管（Microcon YM-10，截留分子量10 kDa，USA）。TGL-16K型高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），JM21200EX透射电镜（日本电子公司），SynergyHTX多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司），BDS-FL型倒置显微镜（日本奥林巴斯公司），HERA cell-150i CO2恒温培养箱（美国赛默飞仪器有限公司），BCM-1300A超净工作台（日本AIRTECH公司）。

SIHE（批号20170315-1），新疆维吾尔自治区药物研究所自制；芦丁对照品（批号100080-201409，纯度>98%），中国食品药品检定研究院；绿原酸对照品（批号110753-201415，纯度>98%），中国食品药品检定研究院。单硬脂酸甘油酯（中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20151002），卵磷脂（上海国药集团化学试剂有限公司，批号F20160322），山嵛酸甘油酯（Compritol 888 ATO，批号3545PPD），吐温- 80（上海国药集团化学试剂有限公司，批号F20161110）。胎牛血清（FBS，Gibco），DMEM培养基（Hyclone），磷酸盐缓冲液（PBS，Gibico），Hank's平衡盐溶液（HBSS，Gibico），胰蛋白酶（Hyclone），二甲基亚砜（DMSO，北京化工厂），维拉帕米（Sigma），根皮苷（Sigma），乙腈（色谱纯，Fisher），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 芦丁、绿原酸含量测定

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Reliasil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 min，13%A；15 min，13%A；16 min，15%A；40 min，l5%A）；流速1.0 mL/min；检测波长：芦丁257 nm，绿原酸327 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 ?L。

2.1.2 混合对照品贮备液的制备

精密称取芦丁对照品4.83 mg、绿原酸对照品5.02 mg，置25 mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解，摇匀，定容，即得芦丁浓度为193.20 ?g/mL、绿原酸浓度为200.80 ?g/mL的混合对照品贮备液。

2.1.3 供试品溶液的制备

称取SIHE粉末5.23 mg，加入甲醇溶液溶解，摇匀，用0.22 ?m微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 专属性考察

精密量取空白SLNs及含药SLNs各3 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇，于60 ℃水浴破坏10 min，用甲醇稀释至刻度，离心，取上清液，过滤。精密吸取混合对照品贮备液2 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度。按上述色谱条件进样，色谱图见图1。供试品色谱中与对照品色谱相同保留时间处有色谱峰，而阴性对照无相应峰，说明样品中其他成分对绿原酸和芦丁的测定无干扰，且两成分色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5。

2.1.5 线性关系考察

分别精密吸取混合对照品贮备液0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 mL加入10 mL容量瓶中，稀释至刻度，即得芦丁浓度分别为2.42、4.83、9.66、19.32、38.64、77.28、154.56 ?g/mL，綠原酸浓度分别为2.51、5.02、10.04、20.08、40.16、80.32、160.64 ?g/mL的系列混合对照品溶液。分别精密吸取混合对照品溶液10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录相应的峰面积。以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得芦丁和绿原酸的标准曲线回归方程分别为Y=25.139X-0.178（r2=0.999 8）、Y=76.521 X-2.612（r2=0.999 9），结果表明，芦丁在2.42～154.56 ?g/mL、绿原酸在2.51～160.64 ?g/mL范围内线性关系良好。

2.1.6 精密度试验

精密吸取芦丁和绿原酸混合对照品溶液10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件测定，连续测定6次，记录峰面积，计算RSD。结果芦丁和绿原酸的峰面积RSD分别为0.71%、1.01%，表明精密度良好。

2.1.7 稳定性试验

按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h测定，结果供试品溶液中芦丁和绿原酸峰面积RSD分别为1.16%、0.59%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.8 重复性试验

按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液5份，精密吸取供试品溶液10 ?L，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果芦丁和绿原酸峰面积RSD分别为1.14%、1.27%，表明本方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验

按“2.1.3”项下方法制备已知芦丁、绿原酸浓度分别为25.12、14.36 ?g/mL的供试品溶液，共3份，准确加入芦丁浓度为38.64 ?g/mL、绿原酸浓度为40.16 ?g/mL的混合对照品溶液0.5 mL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，计算芦丁和绿原酸的回收率及其RSD。结果芦丁的回收率分别为100.72%、98.15%、102.30%，RSD=2.08%；绿原酸的回收率分别为99.58%、101.90%、102.00%，RSD=1.35%。

2.2 天山雪莲提取物固体脂质纳米粒的制备及表征

2.2.1 天山雪蓮提取物固体脂质纳米粒的制备

采用高压匀质法制备SIHE-SLNs。称取处方量的山嵛酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、SIHE，加入适量无水乙醇，在（80±2）℃水浴条件下熔融混合均匀，形成均匀的油相。取处方量的吐温-80分散于水中，在（80±2）℃水浴条件下熔融混合均匀，形成均匀的水相。将油相与水相搅拌混合均匀，加入高压匀质机中进行2次匀质乳化（10 000 r/min），冰水浴冷却，即得。

2.2.2 形态观察

将SIHE-SLNs溶液1 mL用蒸馏水稀释10倍后滴于铜网上，使用2%磷钨酸染色，于透射电镜下观察其形态，结果见图2。透射电镜下，SIHE-SLNs为球形或类球形，大小相近，分布均匀。

2.2.3 粒径及电位测定

将SIHE-SLNs溶液稀释至适当浓度，采用马尔文粒度仪进行粒径及电位测定。结果显示SIHE-SLNs的粒径为（119.08±1.53）nm，多分散指数（PDI）为1.27±1.21，电位为-（16.15±2.02）mV，符合纳米粒的要求，见图3。

2.2.4 包封率测定

采用超滤离心法测定SIHE-SLNs的包封率，以有效成分芦丁和绿原酸为考察指标。精密吸取SIHE-SLNs溶液0.5 mL，加入超滤离心管中，高速离心（14 000 r/min）30 min，吸取下清液，HPLC测定，分别计算芦丁和绿原酸的含量，即为其各自的游离药物含量（WF）。精密吸取SIHE-SLNs溶液0.5 mL，加甲醇1.5 mL，超声破乳，放冷至室温，用0.22 ?m微孔滤膜过滤，进行HPLC测定，计算芦丁、绿原酸含量，即分别为其总药物含量（WT）。包封率（%）=（WT-WF）÷WT×100%。结果SIHE-SLNs中芦丁、绿原酸的包封率分别为（87.78±0.80）%、（83.82±0.32）%，表明SIHE-SLNs具有较高的包封率。

2.2.5 稳定性考察

将制备的SIHE-SLNs分别于4 ℃和常温条件下放置2个月，并分别于15、30、60 d测定其粒径和包封率，结果见表1。SIHE-SLNs在4 ℃条件下稳定性良好，30 d时粒径和包封率变化较小，但仍符合纳米粒的要求；而在常温条件下30 d后粒径和包封率均有较大的变化。

2.3 芦丁、绿原酸在Caco-2细胞中的摄取

2.3.1 细胞培养

将Caco-2细胞复苏，接种于25 cm2细胞培养瓶中，加入5 mL DEME培养基（含10%FBS），于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养，24 h后换液。待细胞长至对数生长期（细胞融合70%～80%）时，使用0.25%胰蛋白酶消化，计数，使用培养基配制成浓度为6×104个/孔的混悬液，接种于12孔培养板中。于细胞培养箱中孵育，24 h后更换新的培养液，第1周隔日换液，第2周每日换液，培养14 d后，弃去培养液，用孵育至37 ℃的HBSS缓冲液洗涤3次，置于细胞培养箱中孵育30 min，以清除细胞表面对药物吸收测定有干扰的物质。

2.3.2 溶液配制

精密称取SIHE粉末，用DMSO溶液配制成10 mg/mL贮备液，用HBSS稀释至相应浓度。

2.3.3 CCK-8试验

将对数生长期的Caco-2细胞1×104个/孔接种于96孔板中，置于5%CO2细胞培养箱中培养24 h。弃去培养基，加入用HBSS稀释至浓度分别为25、50、80、100、150、200、250、300、500 ?g/mL的含1%DMSO的SIHE溶液200 ?L，于细胞培养箱中孵育48 h。每孔加入CCK-8溶液20 ?L，继续孵育2 h后终止培养，于酶标仪490 nm波长处测定吸光度（A），计算细胞存活率（%）。细胞存活率（%）=（A给药组-A空白组）÷（A对照组-A空白组）×100%。结果见图4。可见，SIHE浓度低于250 ?g/mL时，Caco-2细胞存活率>85%，表明其对Caco-2细胞毒性较小。

2.3.4 摄取试验

取“2.3.1”项下生长至14 d的Caco-2细胞，弃去培养基，用HBSS冲洗2次，洗去细胞表面杂质，加入HBSS 1 mL，置于培养箱中孵育30 min，吸除HBSS。分别加入含不同浓度芦丁、绿原酸的SIHE-SLNs和SIHE溶液，培养箱中孵育相应时间后，弃去药液。用4 ℃的HBSS洗去剩余药液，每孔加HBSS 2 mL，使用细胞刮收集细胞，探头超声破碎（功率300 W，超声2 s，停1 s）5 min，获得细胞混悬液。一部分细胞混悬液采用考马斯亮蓝法测定细胞的蛋白质含量；另一部分细胞混悬液加入乙腈溶液，离心（14 000 r/min）去蛋白，取上清液。按“2.1.1”项下色谱条件测定，分别计算SIHE-SLNs和SIHE中芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取量，结果以?g（药物）/mg（蛋白）表示。

2.3.4.1 培养时间对摄取的影响

加入用HBSS稀释的含1%DMSO的SIHE-SLNs和SIHE溶液（芦丁浓度为30 ?g/mL，绿原酸浓度为15 ?g/mL），置于细胞培养箱中分别培养15、30、45、60 min，测定，计算芦丁和绿原酸的摄取量。培养时间对芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中摄取的影响见图5。可见，SIHE-SLNs中芦丁和绿原酸的摄取量高于SIHE，芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取量随时间的延长先增加，在45 min时达到峰浓度，然后趋于饱和，后续培养时间确定为45 min。

2.3.4.2 药物浓度对摄取的影响

加入用HBSS稀释至DMSO含量为1%的SIHE-SLNs和SIHE溶液（芦丁浓度分别为10、20、30、40、50 ?g/mL，绿原酸浓度分别为5、10、15、20、25 ?g/mL）4份，于细胞培养箱中培养45 min，测定，分别计算SIHE-SLNs和SIHE中芦丁和绿原酸的摄取量，结果见图6。可见，SIHE-SLNs和SIHE中芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取均呈浓度依赖性，而SIHE-SLNs的摄取量高于SIHE。

2.3.4.3 P-糖蛋白抑制剂对摄取的影响

取培养至14 d的Caco-2细胞，加入100 ?mol/L维拉帕米溶液，加入SIHE-SLNs和SIHE溶液（蘆丁浓度分别为20、30、40 ?g/mL，绿原酸浓度分别为10、15、20 ?g/mL，DMSO含量为1%），于细胞培养箱中分别培养45 min，测定并计算芦丁和绿原酸的摄取量，结果见图7。SIHE-SLNs和SIHE-SLNs+维拉帕米的芦丁和绿原酸摄取量显著高于SIHE；与SIHE-SLNs比较，SIHE-SLNs+维拉帕米的芦丁摄取无显著变化，绿原酸摄取量逐渐降低。表明P-糖蛋白抑制剂维拉帕米对芦丁在Caco-2细胞中的摄取几乎没有影响，对SIHE-SLNs和SIHE中绿原酸在Caco-2细胞的摄取影响随浓度增加而逐渐减小。

2.3.4.4 根皮苷对摄取的影响

取培养至14 d的Caco-2细胞，加入用HBSS配制的0.5 mmol/L根皮苷溶液，加入SIHE-SLNs和SIHE溶液（芦丁浓度分别为20、30、40 ?g/mL，绿原酸浓度分别为10、15、20 ?g/mL，DMSO含量为1%），于细胞培养箱中分别培养45 min，测定并计算芦丁和绿原酸的摄取量，结果见图8。根皮苷可竞争性抑制SIHE-SLNs和SIHE中芦丁在Caco-2细胞中的摄取，但其对SIHE中绿原酸的摄取量无明显影响。

3 讨论

中药复方由于药理作用具有多靶点、多层次的优点而越来越受到研究者的关注。然而，中药复方也因其化学成分复杂、干扰因素多等而研究难度颇大。此外，中药复方由多种活性成分组成，导致其水溶性受到了极大的影响，进而使其药效大打折扣。因此，提高中药复方的溶解度，从而提高其生物利用度，是目前急需解决的关键问题。

SLNs是一种具有较小粒径和较大包封率的脂溶性给药载体，其较大的比表面积和良好的脂溶性能够促进药物在细胞中的吸收，从而提高其生物利用度。本研究使用高压匀质法制备了SIHE-SLNs，并对其粒径、电位及包封率进行了相应的表征。结果表明，SIHE-SLNs的粒径在100 nm左右，表面带有较大的电荷值，包封率>85%。较小的粒径使SIHE-SLNs具有较大的表面积，而其表面的电荷值能够保证其稳定性。

Caco-2细胞模型容易在体外培养，在常规细胞培养条件下（37 ℃、5%CO2、相对湿度90%、DMEM培养基）即可自发分化形成肠细胞样的细胞，实验条件可精确控制，稳定性好，用药量小，获得的药物结构与吸收相关性的信息量大，可研究药物的吸收机制，预测药物体内吸收和相互作用。本研究考察了SIHE对Caco-2细胞的细胞毒性，结果显示其浓度在250 ?g/mL范围内对Caco-2细胞没有毒性。

摄取试验结果显示，SIHE-SLNs和SIHE中芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取量呈浓度依赖性，由于SIHE-SLNs具有较大的表面积和较高的脂溶性，使其能够与细胞膜相融合，进入细胞的药量增加，从而提高了SIHE-SLNs在Caco-2细胞中的摄取量。SIHE浓度在50～250 ?g/mL范围内，芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取量随时间的增加先增加，在45 min达到峰浓度，60 min达到饱和，且其摄取量呈浓度依赖性。本结果与白宇等[21]研究的芦丁在Caco-2细胞中的摄取结果相吻合。

P-糖蛋白是多药耐药基因（MDR1）调控的外排蛋白，主要参与口服药物在小肠的吸收，通过与底物相结合将其从细胞浆中排出细胞外而降低底物的吸收。本试验考察了P-糖蛋白抑制剂维拉帕米对芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中摄取的影响。结果表明，加入维拉帕米后，芦丁的摄取量稍增加但无明显差异，即P-糖蛋白在芦丁在Caco-2细胞中的摄取中并非主要参与者；维拉帕米可以增加绿原酸的摄取量，但随着浓度的增加作用减弱。

Na+依赖葡萄糖转运载体1有可能参与黄酮类化合物的吸收，其底物根皮苷可以竞争性抑制药物的吸收。本试验考察了根皮苷对芦丁和绿原酸在Caco-2细胞中的摄取的影响。结果表明，根皮苷可显著抑制芦丁的摄取，降低其在细胞中的含量，但对绿原酸的摄取无明显影响。

参考文献：

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