超高效液相色谱-串联质谱法测定热带水果中杀虫双残留

林 涛, 邵金良, 刘兴勇, 王 静, 邹艳虹, 李茂萱, 刘宏程*

(1. 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所， 云南 昆明 650205; 2. 农业农村部农产品质量安全风险评估 实验室(昆明)， 云南 昆明 650205; 3. 云南省保山市龙陵县农产品质量安全检验检测站， 云南 龙陵 678300)

杀虫双是沙蚕毒素类杀虫剂中的代表农药,属有机氮类农药,对外界的害虫具有触杀和胃杀作用,主要用于甘蔗中蛴螬、螟虫等虫害的防治[1]。近年来,因其杀虫效果好、毒性相对较低而广泛应用于其他果蔬种植过程中虫害的防治[2-4]。杀虫双对人畜的毒性属于中等毒性,对水生生物毒性较低[5,6],对家蚕和蜜蜂的毒性较大[7],而杀虫双具有较强的内吸作用,相对于其他触杀性和保护性农药,可能会大量的残留于作物体内,随着食物链进入人体蓄积。然而,国内外很少有关于杀虫双的限量标准,仅我国的农药残留限量标准GB 2763-2016规定了大米、小麦、玉米、鲜食玉米中杀虫双的限量值,而甘蓝、苹果和甘蔗中的限量值仅为临时限量,所涉及的作物种类较少,在苹果和甘蔗中的限量值为0.1 mg/kg,其余作物均为0.2 mg/kg以上。

杀虫双在酸性条件下稳定,在碱性条件下易降解为沙蚕毒素,现有的国家标准GB 2763-2016推荐了测定杀虫双的唯一方法(GB/T 5009.114-2003),就是将杀虫双在碱性条件下降解为沙蚕毒素并对其进行定量分析,然而该方法只针对大米中杀虫双的残留量,且方法操作步骤较多,需要静置过夜降解,耗时费力,灵敏度较差。近年来,大部分的测定方法也是将杀虫双降解为沙蚕毒素并结合气相色谱法[8,9]或气相色谱-质谱联用法[10]进行测定;也有相关文献[11,12]采用液相色谱法对杀虫双进行测定,但是灵敏度较低,无法满足现代分析测定的要求。随着三重四极杆质谱的广泛应用,也有利用液相色谱-串联质谱法测定杀虫双的文献报道[3,13],但是这些方法采用甲醇水溶液作为提取剂,提取溶液中成分较多,对于后续的质谱测定存在一定干扰,同时由于杀虫双极性较大,常规的C18色谱柱对其保留较差,出峰时间较早,溶剂及杂质干扰可能较大。

目前,热带水果中也经常使用杀虫双进行田间防护[14],但热带水果中的糖分较高,水溶性色素较多,采用甲醇水溶液提取时，提取液中会包含糖分和色素等干扰物,从而影响杀虫双的定性和定量分析。因此,寻求快捷简便的提取净化方法以及较优的色谱分离条件是目前测定热带水果中杀虫双残留的首要任务。本研究以热带水果为研究对象,以杀虫双为目标农药,对QuEChERS方法进行改进,针对样品前处理、色谱分离、质谱电离等方面进行系统讨论,旨在提高杀虫双检测的灵敏度和准确度。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

API 4000三重四极杆串联质谱仪(美国AB Sciex公司); 1290超高效液相色谱仪(美国Agilent公司);LP涡旋振荡器(美国Thermo Scientific公司); BSA124S电子分析天平(德国Sartorius公司); TGL-15B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂); Hei-VAP Value Digital旋转蒸发仪(德国海道夫公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯,德国Merck公司);柠檬酸氢二钠(纯度99%)、乙酸和甲酸(色谱纯)(美国Sigma公司);无水乙酸钠、氯化钠、乙酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司); ProElut C18、N-丙基乙二胺(PSA)、NH2和Florisil填料(粒径50 μm,中国迪马科技公司);纯净水(杭州娃哈哈公司);杀虫双(100 mg/L,农业部环境保护科研监测所)。

1.2 试验方法

1.2.1标准溶液的配制

用甲醇将杀虫双标准品稀释为10 mg/L的标准储备液;再吸取0.1 mL标准储备液,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,混匀得到0.1 mg/L的标准溶液,于低温避光保存。

1.2.2样品前处理

准确称取5.00 g经匀浆后的热带水果样品,置于50 mL离心管中,加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液和5.0 g NaCl,涡旋提取5 min后,以5 000 r/min离心5 min,然后移取上层乙腈,置于旋蒸瓶中,再加入10 mL含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液,重复提取一次,合并乙腈层,旋转蒸发仪蒸干后加入2 mL乙腈复溶,转移至50 mL离心管中,加入200 mg PSA、100 mg C18、300 mg MgSO4和500 mg柠檬酸氢二钠,涡旋振荡提取10 s,以5 000 r/min离心5 min后,取上层提取液,经0.22 μm滤膜过滤后,待分析。

1.2.3色谱条件

色谱柱:CAPCELL CORE PC亲水色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm,日本Shiseido公司);柱温:35 ℃;流动相:乙腈-水(95∶5, v/v);等度洗脱;流速:200 μL/min;进样量:5 μL。

1.2.4质谱条件

离子源为ESI源,负离子扫描模式;气帘气流速为20 L/h;雾化气流速为55 L/h;辅助气流速为55 L/h;辅助加热气温度为550 ℃;喷雾电压为-5 500 V;多反应监测(MRM)模式;定量离子对(m/z)为310.0>229.8;定性离子对(m/z)为310.0>185.0;去簇电压分别为-30 V和-30 V;碰撞电压分别为-15 V和-25 V。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

本研究以0.1 mg/L杀虫双为研究对象,首先在正离子模式下对其进行质谱条件的研究,结果表明杀虫双在正离子模式下响应较差,因此采用负离子模式对其进行质谱条件的优化。参照文献[13]中的离子对信息,分别优化相关的离子对条件和电压。图1为杀虫双电离及裂解的原理图,可以看出,杀虫双中S-S键极易断裂,而C-N键也较易断裂,可分别形成两个强度较高的子离子碎片。

图 1 杀虫双质谱裂解原理图

2.2 色谱条件的优化

杀虫双结构中含有双硫代磺酸钠基丙烷取代基,极性较大,在常规ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)上的保留较差,采用乙腈-水(95∶5, v/v)等度洗脱时,出峰时间较早(0.62 min),因此本研究采用CAPCELL CORE PC亲水色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm),可达到较好的保留效果,采用乙腈-水(95∶5, v/v)等度洗脱时,杀虫双在1.85 min出峰,且峰形较好,响应较C18色谱柱高(见图2)。

图 2 采用不同色谱柱时杀虫双的色谱图

2.3 净化方法的优化

2.3.1提取溶剂的选择

杀虫双可溶于甲醇、乙腈和二甲亚砜等溶剂,在丙酮和乙醇乙酯中的溶解度较小。本文比较了甲醇和乙腈对于杀虫双的提取效果,结果表明,甲醇和乙腈对杀虫双的提取效率相当,但是甲醇的极性较乙腈大,提取液中常含有极性较大的干扰物,因此选择乙腈作为提取溶剂,同时采用了二次提取的方式,以增加杀虫双的提取率。二次提取后杀虫双的总提取率在80%以上,达到了较好的提取效果。

实验同时考察了乙酸的加入对提取效率的影响。第一次提取时,乙酸的加入对于提取率没有太大变化,均为50%,但是第二次提取时,不加乙酸,提取率只有10%左右,而加入乙酸后,提取率能够达到30%左右。这可能是因为乙酸的加入能够保持提取过程中溶液的酸性,抑制杀虫双在提取过程中的降解。综合以上,选取含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液作为提取溶剂。

2.3.2净化填料的选择

PSA、C18、NH2和Florisil作为目前常见的净化材料,广泛应用于农药残留检测中[15-18]。本研究分别比较了这几种填料对于杀虫双的净化效果。结果表明,NH2和Florisil对于杀虫双的净化效果一般;PSA的加入能够有效减小基质效应,特别是对一些糖分较高的热带水果,同时C18对于基质中极性较小的化合物能够有效吸附,从而提高净化的总体效果。综合比较,选择PSA和C18作为混合净化填料。

采用2 mL样品提取液,比较了不同含量组合的PSA和C18(50 mg-250 mg、100 mg-200 mg、150 mg-150 mg、200 mg-100 mg、250 mg-50 mg)的净化效果。结果表明,当PSA含量较低时,对杂质的吸附能力较弱,样品基质效应较大,而当PSA含量较高时,对杂质的吸附较强,净化效果较好,但是对杀虫双同样存在一定吸附。低含量的C18对于基质中极性较小的化合物吸附不够,在质谱分析时易造成干扰。综合考虑,选择200 mg PSA和100 mg C18进行吸附净化。

2.3.3缓冲盐的选择

在提取净化时,常加入缓冲盐以保证提取过程中溶液酸碱性的稳定[19,20]。杀虫双在酸性条件下稳定、碱性条件下不稳定,但是其在强酸和强碱环境下易降解。因此,本研究为了保证杀虫双在提取过程中不发生降解,分别比较了添加乙酸钠和柠檬酸氢二钠两种常见缓冲盐的提取效果。结果表明,乙酸钠的加入,使杀虫双的提取率下降,当采用柠檬酸氢二钠作缓冲体系时,杀虫双的提取率较好,明显高于乙酸钠缓冲体系。这可能是因为乙酸钠体系的pH值为5～6[21],而柠檬酸氢二钠体系的pH值为4～5,使杀虫双在提取过程中更稳定性。

实验同时比较了柠檬酸氢二钠的添加量(100、300、500、700和900 mg)对提取效果的影响。结果表明,杀虫双的提取效率随柠檬酸氢二钠添加量的增大而逐渐增大,当添加量为500 mg时达可到较好的提取效果;继续增大柠檬酸氢二钠的添加量,提取效率呈下降趋势。这可能是因为柠檬酸氢二钠含量较低时不能完全维持体系的酸性,杀虫双会少量降解,但是当添加量较多时可能会对杀虫双部分吸附,从而影响提取效率。

2.4 线性范围和检出限

对0.1、0.5、2.5、5.0和10.0 μg/L杀虫双标准溶液进样分析,分别以峰面积对各质量浓度进行线性回归。结果表明,杀虫双在0.1～10.0 μg/L范围内线性关系良好,相关系数(r2)为0.999 3。

选取空白热带水果基质,加入适当浓度的杀虫双,分别以3倍和10倍信噪比(S/N)对应的加标水平为检出限(LOD)和定量限(LOQ)。结果表明,检出限和定量限分别为0.015 μg/kg和0.05 μg/kg,符合农产品中农药残留检测的要求。

表 1 杀虫双的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

2.5 回收率和精密度

本实验采用空白火龙果、菠萝和芒果3种近年来我国进出口贸易量较大的水果作为代表基质,以LOQ、5倍LOQ和10倍LOQ作为添加水平进行加标回收试验和精密度测定,通过6次平行试验的结果计算平均回收率和相对标准偏差(见表1)。结果表明,杀虫双的回收率为81.0%～88.3%,相对标准偏差范围为3.9%～6.2%。

3 结论

本文利用改进的QuEChERS方法,直接提取净化热带水果中的杀虫双,建立了超高效液相色谱-串联质谱快速测定杀虫双残留的方法,快速完成热带水果中杀虫双的定性和定量分析。该法准确度和精密度均满足农药残留测定要求,与传统方法相比,极大缩短了前处理时间,提高了检测灵敏度。