增氧条件下施用有机肥对水稻土壤微生物的影响

张立成，胡德勇，杨敬林，张文萍，肖卫华,

(湖南农业大学 a资源环境学院,b工学院,湖南 长沙 410128)

增氧灌溉是近年来提出的一项新的灌溉技术，其主要目的是解决土壤透气性差、氧气含量不足的问题[1-2]。另外有研究发现，增氧灌溉有益作物生长，并能提高根系活力，增强根系的养分吸收能力[3]。饶晓娟等[4]研究表明，水中增氧对水培棉的生长有明显的促进作用，并且能够增强棉花对氮、磷、钾的吸收。前人在增氧灌溉应用于旱地作物油菜、马铃薯、烟草等试验中均发现，增氧能使作物根系趋于发达，经济产量增高[5-7]。氮、磷、钾是作物生长的主要营养元素，土壤种植作物后每年将会有大量的营养元素被作物吸收，因而土壤中营养元素会逐年减少[8]。为了满足作物对营养元素的需求，人们不断向土壤中施加化肥以弥补营养元素减少造成的肥力亏缺，但是大量施用化肥易造成土壤板结或出现次生盐碱化现象[9]。施用农家畜禽粪便堆肥和绿肥等有机肥也能够补充土壤的氮、磷、钾元素，提高土壤肥力，但其肥效低于化肥，因此作物生长过程中对该类肥料的利用率不高[10]。这是由于有机肥中的各类肥料元素含量虽较高，但都以有机态的形式存在，因此很难被作物直接吸收利用。有机肥在土壤中要经有机态转化成无机态才能成为有效态的肥料，这个转化过程与土壤中的微生物息息相关[11-12]。土壤中不同功能的微生物菌种分解不同有机态肥料元素，目前已从土壤中分离出溶磷菌、解钾菌和固氮菌等对肥效元素起主要转化作用的微生物菌类[13]。不同功能类微生物在土壤中的生长环境不同，土壤微生物按照氧气需求条件可以分为好氧菌、厌氧菌和兼性好氧厌菌三大类。土壤中的细菌、真菌和放线菌的数量及其多样性可以反映土壤环境的生态功能和土壤质量[14]。土壤中氧气含量变化会引起土壤中微生物生长状况的改变[15]，目前关于土壤增氧对施有机肥土壤微生物的影响研究尚鲜有报道。土壤微生物的生物量、群落结构与土壤有机质和土壤肥力密切相关，本研究以土壤微生物量和群落结构特征为切入点，研究土壤增氧和施加有机肥对土壤微生物的影响，以期从土壤微生物方面了解增氧对作物生长的影响机理。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2016年3月在湖南农业大学土肥资源高效利用国家实验室中心试验站(E113°04′50″，N28°11′12″)的透光大棚中进行。试验地属于亚热带季风气候，光照充足，平均日温13.6 ℃，大棚四周设有通风设施，棚内环境与自然环境相近。试验土壤取自湖南农业大学耘园试验基地，为第四纪发育的红黄泥，是南方丘陵地貌的典型土壤。土壤全氮、全磷、全钾含量分别为1.34，0.25，35.56 g/kg，碱解氮、速效磷、速效钾含量分别为70.51，36.70，117.13 mg/kg，有机质含量为16.91 g/kg，pH值6.03，土壤肥力中等。

1.2 供试材料

水稻品种为“深两优5814”，由湖南亚华种业有限公司提供。

绿肥紫云英的主要成分(质量分数)为：纤维素2.94%，蛋白质2.36%，糖类4.18%，可溶性盐类化合物0.61%。农家肥干牛粪的主要成分(质量分数)为：有机质14.50%，粗纤维43.60%，粗蛋白13.74%，粗脂肪1.65%，硝酸盐和磷酸盐等化合物1.29%。

1.3 试验设计

试验采用盆栽种植水稻方法，设计了施用有机肥和增氧2个因素，其中施用有机肥因素包括施用绿肥紫云英、施用农家肥干牛粪以及不施肥3个水平，增氧因素包括加氧和不加氧2个水平，共计5个处理：加氧施用绿肥处理、不加氧施用绿肥处理、加氧施用农家肥处理、不加氧施用农家肥和不加氧且不施肥处理(对照)，编号分别为OG、G、OF、F、CK，每处理6个重复。将试验土壤经自然风干后过孔径0.5 cm筛网，将有机肥与过筛后土壤按一定比例混合，其中绿肥鲜质量与土壤的质量比为1∶20，干牛粪与土壤的质量比为1∶160，将有机肥与土壤混匀后，称取15 kg放入试验桶(试验桶下底直径30 cm，上底直径35 cm，高40 cm)中。加氧处理方式：在试验桶中预先埋置带孔通气管，将通气管与通气泵相连接并用定时器控制2 h通气1次，每次通气4 min，全天进行。通气管铺设时采用塑料软管将其一端扎紧，另一端与通气泵相连，从扎紧端起每隔10 cm打孔，均匀沿软管打10个小孔，然后用纱布缠绕小孔防止泥土堵塞，将带孔软管沿盆四周从底部向上螺旋上升铺设，使土壤中各土层之间通气量均匀。水稻苗移栽3 d返青后开始进行加氧处理，直至水稻收获后停止。于2016年3月5日开始种植水稻，7月20日收获。水稻收割时开始采集土壤样品，取土壤样品时，用带刻度的取土器插入不同深度土层，分别采集0～5,5～10,10～15,15～20,20～25,25～30 cm土层的非根际土样。

1.4 测定指标及方法

土壤微生物数量测定应用稀释菌悬液涂平板法进行：(1)细菌采用牛肉蛋白胨琼脂固态养基培养，土壤悬浊液的梯度稀释度为10-3，10-4，10-5，10-6。(2)真菌采用马丁氏培养基培养，土壤悬浊液的梯度稀释度为10-2，10-3，10-4。(3)放线菌采用改良高氏1号培养基，悬浊液浓度采用10-3，10-4稀释度[16]。土壤微生物群落分析采用磷脂脂肪酸(PLFA)标记，根据质谱图分析，以PLFA19：0为内标物进行定量分析，应用气相色谱质谱仪(GS-MS)对细菌、真菌、放线菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌含量以及PLFA总量进行测定[17-18]。

1.5 数据处理与分析

试验检测获得的数据取6个重复的平均值，用Excel 2010软件整理，利用Origin 8.0进行主成分成析，用Canoco 4.5进行冗余分析，用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，用Duncan’s新复极差法进行多重比较。主成分分析是对多个变量进行降维处理，以确定土壤微生物的主要影响因素，冗余分析是对土壤微生物之间的相关性进行比较分析。

2 结果与分析

2.1 增氧条件下施用有机肥对不同土层微生物数量的影响

土壤微生物数量是反映土壤生物化学活性的一个重要指标。增氧条件下施用有机肥对不同土层土壤细菌、真菌和放线菌数量的影响见图1～3。

图1 增氧条件下施用有机肥对不同土层细菌数量的影响Fig.1 Soil bacteria counts at different soil depths under oxygenation

图3 增氧条件下施用有机肥对不同土层放线菌数量的影响Fig.3 Soil actinomycete counts at different soil depths under oxygenation

图1～3显示，土壤细菌、真菌和放线菌数量随土层深度的增加总体呈下降趋势，说明土壤中的微生物主要集中在土壤表层。土壤表层较多的有机物质及充足的空气和水分可为微生物生长提供良好的环境条件和碳源等营养元素。

图1显示，在0～15 cm土层，OG和OF处理组土壤细菌数量较高；15～30 cm土层，OF和F处理组土壤细菌数量较高;而0～30 cm土层，OF处理组土壤的细菌数量均高于其他处理组，可知在加氧条件下，施用农家肥相对施绿肥处理更能提高土壤细菌数量。随着土层深度的增加，各个处理组土壤细菌数量逐渐趋近相同水平，增氧处理对土层深度大于20 cm土壤的细菌数量无显著影响。

图2表明，0～15 cm土层G处理组以及15～30 cm 土层OG处理组土壤真菌数量均低于其他处理组，可知施加绿肥会降低土壤真菌数量。这是因为绿肥腐化产物中包含胡敏酸和富里酸等有机化合物，这些酸类化合物不利于真菌类微生物生长。在0～25 cm土层，OF和F处理组土壤真菌数量均高于其他处理组，且OF处理组真菌数量大于F处理组。表明施用农家肥可显著提高土壤真菌数量，这是由于农家肥本身含有的真菌数量较大，增氧处理更利于这些真菌类微生物的繁殖；在25～30 cm土层，OG、G、OF、F、CK处理组土壤真菌数量差异较小。

图3显示，在0～25 cm土层，OG和OF处理组土壤放线菌数量均高于G、F处理组，表明施用有机肥后增氧处理能够提高土壤放线菌的数量；在25～30 cm土层，OG、G、OF、F、CK处理组土壤放线菌数量差异较小。在0～25 cm土层，OG、G、OF、F处理组的土壤放线菌数量均高于CK，表明加氧及施用有机肥均能增加土壤放线菌数量。

2.2 增氧条件下施用有机肥对微生物群落PLFA含量的影响

土壤微生物群落分析时，将5个处理组的各土层深度土壤混匀过孔径2 mm筛网后作为待测样品，以PLFA19:0为内标物进行定量分析，结果共检测到32种特定标记的PLFA，但其中只有17种PLFA的含量大于0.01 nmol/g，故本研究只分析了OG、G、OF、F和CK处理组这17种PLFA的含量，结果见表1。

表1 增氧条件下施用有机肥对不同土壤PLFA含量的影响 Table 1 Effect of organic fertilizers under oxygenation on soil PLFA concentration nmol/g

表1中，特定脂肪酸的排列为碳的数目、双键的数目，随后跟随双键的位置，其中c和t分别表示顺式和反式脂肪酸(cis/trans-fatty acids)，a和i分别指反异支链脂肪酸及异式支链脂肪酸(Trans/hetero-branched fatty acids)，cy表示环状支链脂肪酸 (annular branched fatty acids)，10Me表示第10个碳原子的甲基(methyl)，ω表示脂肪酸的甲基第1个双键的位置。表1显示，17种PLFA指示的土壤微生物包括革兰氏阳性菌(i15：0、a19：0、i17：0)、革兰氏阴性菌(16:1ω9c、18:1ωt、16:1ω5c、18:1ω7c)、细菌(16:0、cy17：0、17:1ω6、15:0)、真菌(16:1ω7、18:3ω6、18:2ω6)、放线菌(10Me16:0、10Me18:0)和原核生物(20:3ω6)。5个处理组土壤样品中含量较高的PLFA均为cy17:0、15:0、i15:0、16:1ω9c、18:3ω6、17:1ω6，说明含有这些脂肪酸的微生物在土壤中占优势。以上6种PLFA含量在不同处理组中存在差异，其中CK处理组细菌和真菌类微生物含量均较低，土壤中优势类微生物的检测结果说明，加氧和施肥处理可增加土壤微生物的数量。

2.3 增氧条件下施用有机肥对微生物群落结构的影响

由表2可知，各类微生物类群PLFA总量均以细菌含量最高，其次是革兰氏阳性菌，放线菌含量最低，表明细菌在土壤微生物类群中占有明显的优势。从不同处理土壤微生物类群的PLFA总量看，OG处理组显著大于G处理组，OF处理组显著大于F处理组；5个处理组中，OG和OF处理组均较高，G和F处理组次之，且以上4组均显著高于CK。从土壤细菌含量看，OG处理组显著大于G处理组，OF处理组显著大于F处理组，但是OG、G、OF处理组均显著高于CK，而F处理组与CK差异不显著。从土壤革兰氏阳性菌和真菌含量看，OG处理组显著大于G处理组，但OF与F处理组差异不显著，且以上4组均高于CK。从土壤革兰氏阴性菌和放线菌含量看，OG与G、OF与F处理组差异均不显著，但均高于CK，其中OF、F处理组与CK差异均显著。各处理组革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的比值均无显著差异，说明增氧和施肥处理并未明显改变土壤革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌含量的比值。从土壤真菌与细菌含量的比值看，OG与G、OF与F处理组差异均不显著，表明增氧处理未引起真菌与细菌含量比值的显著变化；但是OG和G处理组均显著低于OF和F处理组，这可能是因农家肥中真菌含量较绿肥高所致。

表2 增氧条件下施用有机肥对土壤微生物类群PLFA含量的影响Table 2 PLFA varieties of soil microorganism clusters under different treatments

注：同列数据后标不同小写字母表示处理组之间差异显著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference among groups(P<0.05).

2.4 增氧条件下施用有机肥对土壤微生物群落多样性的影响

主成分分析可有效地区别微生物类群的多样性特征。通过对PLFA含量的主成分分析发现，第一主成分(PC1)解释了土壤样品61.82%的变量方差，第二主成分(PC2)解释了土壤样品19.14%的变量方差。从图4可知，不同处理组微生物类群在主成分坐标轴上差异明显，其中OF和F处理组在PC1轴的正方向且分布相近，OG和G处理组总体在PC1轴的负方向且分布相近，CK处理组在PC1轴和PC2轴的负方向。相同处理组土壤微生物类群在第一主成分和第二主成分轴上的分布点相同，分布距离较近，不同处理组之间差异较大。施用农家肥或绿肥，以及是否进行加氧处理，其土壤微生物群落结构差异较小，但与不施肥的对照组相比差异均比较明显。这是因为土壤微生物的种类和含量与土壤环境条件密切相关，施肥和加氧处理会对土壤微生物群落产生明显影响。

PLFA标记分析表明，微生物群落与土壤施肥和增氧条件密切相关，本研究对各处理组PLFA含量进行冗余分析,得到RDA排序图见图5。由图5可知，施肥和增氧处理对土壤微生物群落影响较大。在各施肥和增氧处理的RDA排序图中，第一排序轴与土壤细菌和真菌的相关系数分别为0.82和0.99，第二排序轴与土壤放线菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的相关系数分别为0.95，0.74和0.91。细菌、真菌与第一排序轴呈正相关，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌与第二排序轴呈正相关，放线菌与第二排序轴呈负相关。CK处理组微生物群落主要受真菌和细菌的影响，F处理组主要受革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的影响，OF、OG和G处理组主要受放线菌的影响。

图4 增氧及施用有机肥条件下土壤PLFA生物标记的主成分分析Fig.4 Principal component analysis on soil PLFA marked with biology of different treatments

3 讨 论

通氧处理可使土壤不断获得新鲜气体，为好氧微生物提供了良好的生长环境[19]。已有研究发现，对土壤肥效转化产生主要影响作用的是好氧类微生物[20]。本试验研究发现，与CK相比，增氧和施肥处理能够显著提高土壤细菌、放线菌数量，改善微生物群落结构。土壤可培养微生物数量的变化，从一定程度上反映了土壤微生物的丰富度特征。土壤施用农家肥和绿肥等有机肥均主要是对0～15 cm土层微生物数量产生影响，施肥后的加氧处理更能促进土壤微生物生长，这是因为0～15 cm土层中存在较多的好氧微生物，因此增氧处理能对土壤可培养微生物数量产生显著影响。可培养微生物数量的增加，将有效提高土壤肥效元素的释放，肥效元素又能增加微生物生长所需的食物源，良好的生长环境和充足的食物源促进了土壤微生物的快速繁殖，从而使土壤微生物数量增加。土壤微生物数量的改变，则会引起土壤微生物群结构的变化。PLFA生物标记总含量能够反映土壤中各类微生物群落的变化[21]，PLFA生物标记主要是根据不同类群微生物指示PLFAs的不同，通过提取和分离不同途径合成的细胞膜中的成分，由于该成分具有高度的专一性，故可以作为不同微生物类群的标记物[22]。本研究通过磷脂脂肪酸分析法对各处理组土壤样品中微生物群落结构的分布特征进行分析，结果发现这些土壤生物包括细菌、真菌、放线菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和原核生物。施用有机肥的同时进行增氧处理，其PLFA总量均显著大于不增氧处理组，可知增氧处理能够明显提高施有机肥土壤中的微生物数量。本试验中，不同处理组土壤各类菌群微生物含量有一定差异，说明不同施肥处理对土壤微生物群落结构产生了影响，这与一些学者的研究结果相同，即施用有机肥和加氧处理不仅显著提高了微生物活性，而且丰富了微生物的多样性[23-24]。主成分分析中，施用绿肥处理与施用农家肥处理组的土壤微生物类群分布点在主成分轴上距离相差较大，其中F和OF处理组主要分布在PC1轴的正方向，G和OG处理组主要分布在PC1轴的负方向，说明两类施肥方式中土壤微生物类群组成差别较大。这与前人研究得到的“施有机肥可提高土壤微生物活性、改善微生物群落结构和功能”的结果[25-26]相同。

4 结 论

本试验通过施用2种有机肥及增氧处理研究水稻土壤微生物的变化特征，结果表明，施用农家肥或绿肥均可提高土壤微生物数量，其中施农家肥加氧处理组(OF)土壤细菌、真菌、放线菌数量较CK明显增多，且亦高于其他处理组。各处理组土壤微生物数量由高到低表现为,增氧施用有机肥处理组>施用有机肥处理组>CK。增氧和施用有机肥处理与不同微生物群落结构组成有一定的相关性，冗余分析结果表明，增氧处理与土壤中的放线菌类微生物有较高的相关性，施农家肥处理与土壤中的革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有较高的相关性。