壳聚糖的定向修饰及其衍生物性能研究

易 喻，代茹楠，张彦璐，陈建澍，应国清*

（浙江工业大学药学院，浙江 杭州 310014）

天然壳聚糖是一种高分子量的直链多糖，由β-（1-4）-2-乙酰胺基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖和 β-（1-4）-2-氨基-2-乙酰胺基-2-脱氧-β-D-葡萄糖交替结合而成，在自然界中非常丰富，是昆虫和甲壳类动物外骨骼的组成成分[1]。壳聚糖无毒害[2]，拥有良好的生物降解能力[3]，生物相容性[4]，无抗原性[5]，抑菌性[6]和促进伤口愈合的能力[7-8]。壳聚糖在农业、环境保护、制药、医学以及食品工业上都有广泛的应用[9-10]。然而由于壳聚糖只能溶于pH=6.5以下的酸性水溶液中 （如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、柠檬酸等）[11]，因此相关的应用受到了很大的限制。壳聚糖本身的刚性结构和分子内强烈的氢键作用是导致其水溶性差的主要原因，改善壳聚糖的水溶性通常有三种途径：①控制壳聚糖的脱乙酰度[12-13]，对高脱乙酰度高的壳聚糖进行酰化反应，破坏壳聚糖原有致密晶体结构，使其脱乙酰度（DD）控制在50%左右；②将壳聚糖在适当条件下降解为低分子量（<5000 D）的水溶产物[14]。③ 利用壳聚糖分子结构中的羟基和氨基的反应活性，在其分子链上引入亲水基团，并破坏分子内的氢键作用。酰化[15]、季胺化[16]、羧甲基化[17]均能削弱分子内氢键从而增加了壳聚糖的水溶性。已有的研究和实践已获得一些阶段性的结果[18-20]，但还有些问题值得进一步研究，如-OH和-NH2，哪个是改善水溶性的关键等。

因此，本论文利用不同的反应原理定向在壳聚糖的-OH或者-NH2上修饰上同样的疏水基团苯甲酰基），表征后研究N-苯甲酰壳聚糖和O-苯甲酰壳聚糖之间的溶解性的差异，分析差异产生的原因。

1 材料与方法

1.1 材料

壳聚糖（DD ≥ 90%，MW=205 kD）（浙江澳兴生物技术有限公司）、苯甲酰氯（上海生物化工有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 N-苯甲酰壳聚糖的制备

在室温下，将1.0 g壳聚糖溶于45 mL 0.2 mol/L的HCl水溶液，然后加入15 mL丙酮，搅拌15 min，向上述溶液加入2 mL吡啶，继续搅拌15 min。将2.0 e.q.-NH2的苯甲酰氯溶于15 mL丙酮，用恒压滴定漏斗缓慢滴加到壳聚糖的HCl/丙酮/吡啶混合溶液中，50℃搅拌反应3 h。反应结束后将溶液倾倒入400 mL丙酮中得到沉淀，抽滤得到固体，固体再用丙酮和无水乙醇洗涤3～5次，加30 mL水溶解后放入透析袋中透析3～5 d，冻干后得到N-苯甲酰壳聚糖。

图1 N-苯甲酰壳聚糖1的合成路线

1.2.2 O-苯甲酰壳聚糖的制备

在室温下，1.0 g壳聚糖溶于15 mL甲磺酸中，搅拌15 min至完全溶解，之后将上述溶液放置于0℃冰浴，待溶液的温度达到冰浴温度后，向反应液中一边搅拌一边缓慢滴加苯甲酰氯，手工搅拌1 h后于室温下搅拌反应3 h，最后放置于-20℃冰箱过夜。次日取出反应液，放于室温使之融解，立即与200 mL冰水混合，抽滤取沉淀，沉淀用30 mL水溶解后用2 mol/L的NaOH溶液中和至中性，用丙酮沉淀后取沉淀，用无水乙醇和丙酮洗3～5次后溶于30 mL纯水，加入透析袋透析3～5 d，之后冻干得到O-苯甲酰壳聚糖。

图2 O-苯甲酰壳聚糖2的合成路线

1.2.3 壳聚糖脱乙酰度测定

根据文献[21]的酸碱滴定法，准确称量0.20 g烘干到恒重的壳聚糖及其衍生物样品，溶于20.00 mL 0.1 mol/L经标定的盐酸溶液中，加入甲基橙和苯胺蓝的混合指示剂，用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定，溶液颜色从紫红变蓝绿色。每个样品的脱乙酰度测定三次，取平均值为样品的脱乙酰度。

1.2.4 壳聚糖衍生物取代度的测定

（a）N-糖基化壳聚糖的氨基取代度可由以下公式计算：

（b）通过1H NMR对壳聚糖骨架C2-C6上H以及取代基上的H进行积分，根据以下公式计算得到N-或O-取代壳聚糖衍生物的修饰率：

式中：n为取代基上的H的个数。

1.2.5 壳聚糖衍生物溶解度的测定

参照文献[22]的方法，精确称取0.05 g壳聚糖衍生物，加入5 mL去离子水，机械搅拌3 h，然后用0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，未通过滤膜的物质干重设为m1，则这种衍生物的溶解度 =（0.05-m1）/5×100，单位为 g/100 mL。

1.2.6 表征

（1）FTIR 光谱

将样品研碎后与KBr粉末混合压片，在红外光谱仪上进行测定，找出相关基团的特征吸收峰。

（2）核磁共振 NMR

样品溶于D2O或者D2O和DCl的混合溶剂，作1H NMR。

2 结果与讨论

2.1 FTIR光谱

图 3（a）为壳聚糖原料的红外谱图，图中593 cm-1为O-H面外弯曲，665 cm-1为N-H面外弯曲，1083 cm-1为C-OH的伸缩振动吸收峰，1384 cm-1处为CH3的对称变形振动 （酰胺III带），1597 cm-1处为氨基N-H的变形振动峰，2873 cm-1为C-H伸缩振动峰，3264cm-1为N-H伸缩振动吸收峰，3425 cm-1为O-H的伸缩振动吸收峰。

图3（b）为N-苯甲酰壳聚糖的红外谱图，新出现在1633 cm-1处的吸收为二级酰胺 （酰胺I带）C=O的伸缩振动，出现在1533 cm-1处的吸收为苯环的骨架振动吸收峰，3264 cm-1处的吸收减弱说明了苯甲酰化发生在C2-NH2上；1083 cm-1处的吸收峰几乎没有变化，说明壳聚糖的-OH不参加反应。

图3（c）为O-苯甲酰壳聚糖的红外谱图，从上至下分别为投料比（壳聚糖：苯甲酰氯）为1：1，1∶2和1∶4的产物。从图上可以看出：

（1）当投料比为1∶1时，能够说明壳聚糖C2-NH2发生酰化反应的吸收峰变化为：1637 cm-1处的新吸收峰为二级酰胺（酰胺I带）C=O的伸缩振动说明有酰胺键生成，1597 cm-1处的吸收减弱说明C2的-NH仍在，3264 cm-1处的吸收减弱页说明C2-NH2上也发生了苯甲酰化；说明壳聚糖-OH发生酰化反应的吸收峰变化为：1715 cm-1处出现的C=O伸缩振动吸收峰说明-OH发生酰化但是酰化程度不高，1083 cm-1处C-OH的伸缩振动吸收峰迁移至1049 cm-1也说明了这点。说明苯环存在的变化为：新的苯环特征吸收峰716 cm-1出现。

（2） 当投料比为 1∶2时，1720 cm-1处 C=O伸缩吸收变得更强，苯环吸收峰716 cm-1也变强，出现新的苯环伸缩振动峰1601 cm-1和684 cm-1，这些都说明DS较投料比1∶1时有所上升。

（3）当投料比为1∶4时，图形和投料比1∶2时类似，1548 cm-1处酰胺II带吸收加强，说明C2-NH2进一步参与反应，DS在进一步增加。

（4） 当投料比为 1∶6 时，1720 cm-1处 C=O伸缩吸收进一步加强，3062 cm-1处的苯环C-H伸缩振动继续变强。

2.2 1H NMR核磁分析

如图4所示，1为N-苯甲酰壳聚糖的氢谱（D2O），2为O-苯甲酰壳聚糖的氢谱，且自上往下依次为投料比 （壳聚糖： 苯甲酰氯）1∶1（D2O&CF3COOD），1 ∶2（DMSO），1 ∶4（DMSO）和1∶6（DMSO）的产物的氢谱。

N-苯甲酰壳聚糖：δ=1.9为乙酰基的甲基上3个 H，δ=2.75为壳聚糖骨架 C3上的 H，δ=3.53～3.80为壳聚糖骨架 C2，C4，C5和 C6上的 5个H，δ=4.86为壳聚糖骨架C1上的一个H，δ=7.34～7.52为苯环上C2-C4上的3个H，δ=7.67～7.74为苯环上C1和C5上的2个H。

O-苯甲酰壳聚糖：（1）1∶1∶δ=1.88为乙酰基的甲基上3个H，δ=3.45～3.96为壳聚糖骨架C2，C4，C5和 C6上的 5个 H，δ=4.75为壳聚糖骨架 C1上的 H，δ=7.2为 N-H，δ=7.40～7.53为苯环上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6个 H，δ=7.80～7.91 为苯环上 C1，C5，C1’和 C5’上 4 个 H；（2）1∶2～1∶6∶δ=3.00～4.20为壳聚糖骨架上的 7个H，δ=7.2为 N-H，δ=7.40～7.53为苯环上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6个 H，δ=7.80～7.91为苯环上C1，C5，C1’和 C5’上 4 个 H。

通过积分计算可得物质1的DS为0.52，21∶1的 DS为 0.43，21∶2的 DS为 0.53，21∶4的 DS为 0.75，21∶6的 DS为 1.08。

2.3 壳聚糖衍生物的溶解性

图 3 壳聚糖 0（a），N-苯甲酰壳聚糖 1（b），O-苯甲酰壳聚糖 2（c）的 FTIR 谱图

苯环是一种疏水性基团，微溶于水，溶于大多数有机溶剂。苯甲酰基团的引入能够阻碍分子内和分子间氢键的形成，从而改变壳聚糖衍生物的溶解性能。如表1所示，壳聚糖原料只溶于0.2 mol/L AcOH溶液，而DS＞0.44的N-苯甲酰壳聚糖开始表现出水溶性，DS为0.52的样品溶于任何pH值的水溶液，苯环的作用更类似于一个“物理上的支架”，因此衍生物的溶解性不受pH值的影响，在纯水中的溶解度可达10.7 g/L，配成25 g/L的浓度也能够形成透明的凝胶状物质。所有的N-苯甲酰壳聚糖都不溶于0.5 mol/L NaOH、DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF和乙醚，都溶于4.8%LiOH／8%尿素水溶液。N-苯甲酰壳聚糖的DS随着反应温度和苯甲酰氯投料量的增加而上升，随着相转移催化剂吡啶的比例增加呈现出先增大后减小的趋势，原因是过量的吡啶会造成壳聚糖的析出，从而降低了DS。DS越高的样品特性粘度越大，原因是苯环的接入会使得分子与分子之间的作用力变大，从而导致流动性变差。随着DS的升高，特性粘度也会呈现下降的趋势，这是因为接枝反应导致分子链的断裂从而使得分子量降低，特性粘度也相应有所下降。

O-苯甲酰壳聚糖2的溶解性则较为复杂，2DS=0.43的样品能够部分溶于水和0.5 mol/L NaOH，溶于0.2 mol/L AcOH和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，不溶于 DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF 和乙醚，溶解后溶液呈淡黄色。2DS=0.53和2DS=0.75的样品能够部分溶于水、0.5 mol/L NaOH、CH3Cl和 DMF， 溶于0.2 mol/L AcOH、DMSO和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，不溶于丙酮和乙醚，2DS=0.53溶解后溶液呈淡黄色，2DS=0.75溶解后溶液无色透明。2DS=1.08的样品能够部分溶于水、0.2 mol/L AcOH、0.5 mol/L NaOH、丙酮、氯仿和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，溶于DMSO和DMF，溶解后溶液无色透明。 不难看出，随着DS的上升O-苯甲酰壳聚糖的疏水性更强，能够溶于更多的有机溶剂，而在水溶液中的溶解性开始下降。

图4 N-苯甲酰壳聚糖1和O-苯甲酰壳聚糖2的1H NMR

表1 衍生物1和2的DS和溶解性

3 结论

本文通过定向修饰的方法获得了两种壳聚糖衍生物N-苯甲酰壳聚糖1和O-苯甲酰壳聚糖2，并对衍生物进行了FTIR、1H NMR表征，证实了这些衍生物的修饰成功。同时更进一步研究了接枝部位及DS对衍生物溶解性的影响，实验结果表明：在-NH2上修饰疏水可以阻碍壳聚糖分子内和分子间氢键的形成，增加壳聚糖的水溶性；在-OH上修饰疏水性基团还能增加壳聚糖的有机溶剂溶解性（O-苯甲酰壳聚糖），该研究为壳聚糖的定向修饰改性提供了一定参考价值。