稻瘟病抗性基因Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh在宁夏水稻种质资源中的分布

张 敏， 李培富， 张银霞

(宁夏大学农学院，宁夏银川 750021)

水稻作为世界上第二大粮食作物，世界上近一半的人口都以此为食。亚洲人口占世界人口总数一半以上，但其稻米的产量和消费量在全球的比例却在90%以上。由稻瘟病病菌(Pyriculariagrisea)引起的稻瘟病是威胁水稻生产安全的主要障碍因素之一[1]。稻瘟病俗称水稻癌症，全球每年因稻瘟病损失约50亿美元；我国稻瘟病年发生面积约380万hm2，年损失稻谷约10万t，稻瘟病流行年份重病区一般减产10%～20%，严重时减产40%～50%，甚至颗粒无收[2]。由于其危害面积与危害程度都日趋严重，已成为水稻持续高产稳产的严重障碍。在生产上一般通过化学防治和种植抗病品种来控制稻瘟病。化学防治手段虽然能发挥一定的作用，但在病害流行年份收效甚微，且容易造成环境污染，并不能从根本上解决稻瘟病的危害。长期生产实践表明，在众多的防治措施中抗病品种的培育和种植是控制该病害最为经济、安全、有效的方法[3]。对作物品种培育而言，抗病基因的发掘与利用是抗病育种的基础和核心。截至目前已定位的抗稻瘟病基因至少报道了69个位点共84个主效基因，但关于宁夏水稻抗稻瘟病基因的报道较少，宁夏水稻所含抗稻瘟病基因类型和抗性也尚不明确。因此，本研究利用与抗病基因Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh紧密连锁的功能标记，对75份宁夏水稻种质资源材料的抗病基因进行分子检测，旨在充分了解宁夏推广品种中抗病基因的分布规律，以期为培育高产、优质、抗病的水稻品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

选用来自于宁夏大学、宁夏农林科学院等宁夏选育及宁夏外引水稻品种共75份作为供试材料，分别为大胚稻、巨胚稻、耐贮藏、银玉、江苏省农业科学院中梗、圣稻13、圣稻14、圣稻15、圣稻16、圣稻17、临稻11、香梗9407、圣香梗2572、绿米、小粒糯、降糖稻、大粒稻、高粱稻-1、高粱稻-2、奥326、吉梗44、LDC355、L0307S、吉2000F59、宁粳36号、宁粳43号、优育41、宁粳24号、盐丰47、吉大6号、松辽5号、松辽6号、松辽7号、春香糯1号、Z-22、花118、花119、节11、沈稻121、2001QX-62、11NX-2417、SD-1、SD-2、2007XZ-181、法国稻、Agostone、富源4号、宁梗38号、宁梗28号、宁梗35号、宁梗40号、吉梗105、宁梗37号、花94、宁大95、2004D4、宁梗41号、宁梗33号、龙梗31、龙梗36、春优1号、垦08-1806、垦稻12、松辽08-27、通98-56、通系929、通粘1号、通院835、空育131、J-206、宁梗12号、Bertone、越光、湼罗、杨和白皮稻等。

试验于2016年于宁夏大学遗传育种实验室进行。

1.2 试验方法

1.2.1 引物合成Pi-b、Pi-d2、Pi-5、Pikh等基因的PCR特异性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名称、序列、预期片段等信息如表1所示。

表1 稻瘟病抗性基因的引物序列

1.2.2 基因组DNA提取 采用十二烷基硫酸钠法提取水稻基因组DNA，并用琼脂糖电泳检测DNA的质量浓度。以DNA为模板进行PCR扩增，采用20 μL反应体系：2.0 μL 20 ng模板DNA、0.4 μL 2.5 μmol/mL dNTP、0.2 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)、2.0 μL 10×Buffer(含Mg2+)、ddH2O补足20 μL。PCR反应程序：抗病基因Pi-d2、Pi-5、Pikh的扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min；结束后放入4 ℃冰箱保存。抗病基因Pi-b扩增的其他条件与上述基因相同，但退火温度为58 ℃，结束后放入4 ℃冰箱保存。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统拍照。

1.3 数据处理

利用Excel 2007对所得数据进行统计。

2 结果与分析

2.1 Pikh、Pi-5、Pi-b、Pi-d2基因功能标记的检测

利用与抗稻瘟病基因紧密连锁的4个功能标记基因Pikh、Pi-5、Pi-b、Pi-d2对75份宁夏水稻自育及外引材料进行抗病基因的分子检测。由图1可知，抗病基因Pikh功能标记为共显性标记，携带Pikh抗病基因的品种能扩增出 216 bp 大小的片段条带，不含Pikh抗病基因的品种会扩增出359 bp大小的片段条带；由图2可知，抗病基因Pi-5功能标记为共显性标记，即携带Pi-5抗病基因的品种能扩增出 206 bp 大小的片段条带，不含Pi-5抗病基因的品种会扩增出307 bp大小的片段条带；由图3可知，携带Pi-b抗病基因的品种能扩增出803 bp大小的片段条带；由图4可知，携带Pi-d2抗病基因的品种能同时扩增出1 009 、629 bp大小的片段条带，不含Pi-d2抗病基因的品种只能扩增出1 009 bp大小的片段条带。

2.2 宁夏水稻品种抗稻瘟病基因的分子检测

对宁夏水稻品种抗稻瘟病基因进行分子检测，由表2可知，75份材料中含有抗稻瘟病基因Pi-b的材料有37份，占供试品种总数的49.33%，含有Pikh基因的材料有56份，占供试品种总数的74.67%，含有Pi-d2基因的材料有7份，占供试品种总数的9.33%，含有Pi-5基因的材料有23份，占供试品种总数的30.67%(图5)。其中有6份材料为杂合，分别为大胚稻、巨胚稻、小粒糯、宁粳43号、花119、Agostone，4个抗稻瘟病基因都未检测出的材料有5份，分别为银玉、垦08-1806、通粘1号、空育131、越光。

3 讨论与结论

水稻稻瘟病抗性是一个典型的质量-数量性状，抗病性表型既由基因控制又受环境影响[8-10]，因此传统的育种方法很难进行准确选择，而利用分子标记辅助选择育种法选育抗病品种不但准确、高效、安全，而且可以在早期选择，在抗病性育种中显示出独特的优势。随着DNA分子标记技术的发展，开发并应用于抗病基因紧密连锁的功能标记大大提高了抗源筛选和抗病基因鉴定及育种选择效率，已成为正确选择抗病基因更有效的途径[11]。近年来，国内外学者相继对水稻品种的抗瘟基因型开展了研究。时克等利用基因自身的功能标记检测了58个水稻品种中Pi-ta、Pi-b基因的情况及其分布状况[12]；陈涛等利用Pi-ta、Pi-b基因的功能标记功能，对40个粳稻品种和665个粳稻新品系进行了基因型检测，明确了抗病基因Pi-ta、Pi-b在江苏粳稻品种中具有一定的分布，其中Pi-b基因的分布频率较高[13]。但在稻瘟病抗性育种中，功能标记仍然存在着基因定位结果不精确或不准确等问题，且稻瘟病病菌的致病性变异较快，一般认为每隔5～7年，致病性便会出现明显差异[14]。因此，基因聚合是培育稻瘟病持久抗性的有效方法。倪大虎等结合杂交和分子标记辅助选择技术，经田间多代选育和抗性鉴定，将抗稻瘟病基因Pi9(t)和抗白叶枯病基因Xa21聚合到同一品系中，得到了2个抗性基因纯合且农艺性状稳定的植株[15]。

本研究利用与抗病基因Pi-b、Pikh、Pi-5、Pi-d2紧密连锁的功能标记，对75份宁夏水稻种质资源材料的抗性基因进行了分子检测，结果表明49.33%的检测品种中含有抗稻瘟病基因Pi-b，74.67%的检测品种含有稻瘟病抗性基因Pikh，以上2个基因在75份宁夏水稻种质资源品种中均广泛存在，因此这2个基因在水稻抗病性中的利用价值不大；30.67%的检测品种含有稻瘟病抗性基因Pi-5，9.33%的检测品种含有稻瘟病抗性基因Pi-d2，即这2个基因是水稻检测品种中普遍缺少的，因此，Pi-d2、Pi-5基因是今后改良宁夏水稻种质资源品种稻瘟病抗性的主要抗病基因。

表2 宁夏水稻品种抗稻瘟病基因的分子检测结果

注：“+”表示携带抗病基因；“-”表示不携带抗病基因。