基于线粒体nad1 intron 2序列的金钗石斛和混淆品亲缘关系及DNA条形码研究

丁 鸽， 张代臻， 丁小余， 蔡照胜， 商士斌

(1.盐城工学院化学化工学院，江苏盐城 224003； 2.南京师范大学生命科学学院，江苏南京 210046； 3.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室，江苏盐城 224002； 4.中国林业科学研究院林产化学工业研究所，江苏南京 210042)

石斛是我国兰科石斛属(Dendrobium)的珍稀濒危物种，主要分布于我国植物区系学上的热点地区“岭南地区”和“华中地区”[1]，长于海拔800～1 600 m的悬崖岩石或树干上。石斛属为兰科第2大属，在我国共有74种和2个变种[2]。独特的生境造就了石斛药材的非凡品质，早在《神农本草经》中石斛药材就被列为上品，应用历史悠久，具有养阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效[3]。金钗石斛是《中华人民共和国药典》(2005版)[4]收录的适合加工成药材的5种石斛之一，由于相似的外形及组织结构，其他许多同属植物及金石斛属、石仙桃属的植物在加工后被用于冒充石斛正品在市场出售[5-6]。准确鉴定石斛种类是保证药材质量和药理活性研究的重要前提，对于濒危物种的资源保护也具有重要意义。

nad1基因编码线粒体呼吸传递链的复合体Ⅰ-泛醌氧化还原酶(也可称NADH脱氢酶)的nad1亚基，是1个结构较为稳定的线粒体基因，由5个外显子构成[7]，依次是nad1/a～nad1/e。nad1基因的内含子2序列位于nad1/b和nad1/c之间，可能与mRNA成熟的反式剪接机制有关。植物线粒体中许多基因存在进化较快的内含子，加上被子植物线粒体是母系遗传，因此线粒体DNA片段信息同样提供了重要的进化信息，在植物系统发育重建、居群生物学和生物地理学研究中有许多成功的报道[2，8-9]。SNP(single nucleotide polymorphism)称为单核苷酸多态性，是指在染色体基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换、插入及缺失等形式[10]。SNP具有位点丰富、更高的遗传稳定性、易实现分析的自动化等特点[11-12]，广泛地应用于疾病检测、分子育种及中药材鉴别等领域[13-15]。

AS-PCR，即位点特异性PCR，首次利用是DeSalle等在Nature上发表的对鱼子酱中鱼卵所属鲟鱼的种类进行鉴别[16]。在中药材鉴定领域，有姜黄、大黄、齿瓣石斛、铁皮石斛等的位点特异性鉴别研究[17-20]。DNA序列分析是常用于植物分子系统学研究的一类重要的分子标记，它是通过比较DNA序列的差异来反映生物体在遗传上的差异，在此基础上发展起来DNA barcoding(DNA条形码)技术，被越来越多地应用于中药材鉴定的研究中。DNA条形码是基于DNA片段来表征生物物种身份并且有足够变异位点同时容易扩增的技术[2，21]，已经在人参、金银花、石斛等中药材基原植物的鉴定中得到广泛应用[22-25]。本研究拟对金钗石斛及其近缘物种的nad1基因内含子2序列进行研究，确定该序列作为DNA条形码的可行性并寻找SNP分子标记，研究基因片段在植物鉴定方面的应用并探讨金钗石斛的进化地位，为濒危物种的保护生物学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用材料主要采自云南、广西、广东等地，各种植物的种类、来源及GenBank登录号详见表1。

1.2 基因组DNA提取

取硅胶干燥的材料叶片0.1 g，用无菌水冲洗干净，采用改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法[26]提取叶片总DNA。利用紫外分光光度计测定所提取的DNA模板质量，评价其DNA浓度及纯度，于-20 ℃保存。

表1 供试材料来源及登录号

1.3 引物设计及PCR扩增

引物根据Zhang等对石斛属植物的研究[27]设计，序列如下：nad1 F，5′- GCATTACGATCTGCAGCTCA-3′；nad1 R，5 ′-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3′。PCR扩增反应在 30 μL 的反应体系中进行，包括10 mmol/L Tris-HCl(pH值为8.3)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 UTaq酶，200 mmol/L dNTPs，各10 pmol/L 引物，DNA模板约80 ng。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.4 PCR产物纯化与测序

PCR产物用美国Axygen试剂盒纯化，纯化产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5 DNA序列分析

所得石斛属植物的序列用Clustal X 1.8软件完成比对，用Mega 5.0软件分析碱基组成、变异位点数、简约信息位点数、转换和颠换数。以Kimura-2参数计算遗传距离，以牛齿兰(Appendiculacornuta)为外类群，分析植物的种间变异，构建UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean，非加权组平均法)系统发生树，分析石斛属各物种的亲缘关系。

1.6 位点特异性引物设计及扩增

运用Clustal X1.8、Mega 5.0软件对所得序列进行排列，根据碱基位点的变异设计特异性引物，对金钗石斛及其混淆品进行鉴别。扩增反应的引物序列如下：JCF，5′-CTAAACGA-CGAGCAAACACT-3′；JCR，5′-AATTTCTG-CGCCCTAAGAAGC-3′。30 μL的反应体系包括3 μL 10×PCR buffer，2 μL 25 mmol/L MgCl2，2 μL 2 mmol/L dNTPs，1 UTaq酶 ，1 μL 10 pmol/L 引物，100 ng DNA模板。反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1.5 min，共30个循环；72 ℃延伸7 min。

2 结果与分析

2.1 nad1 intron 2序列的长度和变异

金钗石斛及其近缘物种(不含外类群)的nad1intron2序列长度为774～852 bp，长度变异较大，其中金钗石斛的nad1内含子2序列长度为843 bp。经Clustal X 1.8和MEGA 5.0软件排序，简并序列长度为871 bp。其中碱基组成平均含量T为18.2%、C为25.6%、A为25.8%、G为30.4%，GC含量为56%，GC含量明显高于AT含量，其中金钗石斛GC含量为55.8%，各样本的序列长度及碱基含量见表2。

表2 金钗石斛及混淆品nad1 intron 2序列长度及碱基组成

15种石斛有保守位点817个，变异位点27个，简约信息位点5个，单变异位点22个。共有6处indels(碱基缺失)，其中较长的indels位于349～417、579～596 bp，不同的物种表现出缺失碱基的长度和位置的差异；较短的indels位于 140～146、445～451、522～528、610～613 bp，最大的长6 bp，最小的长4 bp。

2.2 基于SNP的金钗石斛的鉴别

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，简称SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。金钗石斛与其混淆品之间存在22个SNP位点，可以用于物种之间的鉴别。在获得的15种石斛的nad1intron2序列中，金钗石斛在第603位上的碱基为T，其他种类均为C，该位点可以作为金钗石斛与其混淆品的种间鉴别的有效位点。根据特异性位点设计的引物用于石斛植物的扩增，结果显示，只有在金钗石斛中产生了大约400 bp长度的单一条带，说明该变异性引物用于物种鉴定的可行性。

2.3 遗传距离的计算及基于DNA barcoding的石斛属亲缘关系分析

应用MEGA 5.0进行序列分析，以Kimura-2参数计算各物种之间的遗传距离，结果见表3。从遗传距离来看，铁皮石斛与黄花石斛遗传距离差异最小，为0，而兜唇石斛与齿瓣石斛的差异最大，为0.010，平均遗传距离为0.004。外类群牛齿兰与15种石斛的遗传距离为0.147～0.156。利用MEGA 5.0软件对获得的序列片段进行分析，构建序列进化UPGMA树(图1)。UPGMA树分析发现，矮石斛、报春石斛、黄花石斛、铁皮石斛首先聚为1支，然后与玫瑰石斛、粉花石斛、细叶石斛、流苏石斛、束花石斛形成的分支聚为1支，最后与晶帽石斛、球花石斛、金钗石斛、兜唇石斛、齿瓣石斛依次聚类，形成与牛齿兰并列的2个大支。可以看出，nad1intron2序列可以对石斛种类进行有效的鉴别，适宜作为分子条形码用于金钗石斛及其近缘物种的亲缘关系分析。

表3 基于nad1 intron 2序列的石斛属及牛齿兰遗传距离分析

注：物种编号同表1。

3 讨论与结论

DNA是植物细胞的遗传物质，具有稳定、可靠、不受外界影响和可遗传性等优点，可以作为药用植物鉴别、植物分类及进化关系分析的依据[28-32]。线粒体基因含有较好的位点多样性水平，基因重排对于近缘物种的鉴定具有较大的意义，在动物中广泛应用于谱系地理、系统发育、DNA条形码鉴定等研究[33-34]。而植物线粒体基因组远大于动物线粒体基因组，变异幅度可能高达10倍以上，在同一科中也可能存在较大差异[35-36]。nad1intron2序列用于药用植物的鉴别并有效地追溯其原产地[2，27]、稻族的系统发育及分析鉴定[37]、挪威云杉不同居群的遗传关系分析[38]等研究，均取得了较好的效果。本试验通过对15种石斛的研究发现，线粒体基因nad1intron2变异位点数量为27个，可用于金钗石斛及其混淆品的鉴别。

与其他分子标记相比，SNP具有位点丰富、检验成本低、更高的稳定性及检出率高等优点，被广泛应用于植物遗传育种、物种鉴别及中药材的鉴定研究中[15，39]。位点特异性鉴别PCR(allele-specific diagnostic polymerasechain reaction，简称AS-PCR)具有操作简单、高效等特点，亦被广泛应用于药材及其混淆品、伪品的鉴别[6，15]。而线粒体基因序列中含有的SNP位点，方便结合AS-PCR等技术，更利于物种的鉴定。本研究中，存在于603位的SNP位点，可以成功地鉴别金钗石斛与其混淆品，为石斛属植物的鉴别及其他中药材的物种鉴定及规范中药材市场提供理论依据。

DNA barcoding是2003年由加拿大圭尔夫大学的Paul Hebert正式提出的，是利用1段短的、标准的DNA片段，从基因组标准化区间对物种进行快速、准确的鉴定[40]。DNA条形码的优点包括不受样品形态和发育阶段限制、准确性高等，可以从分子层面构建物种的序列库并快速有效地进行鉴别，可以促进物种的鉴定分类及保护生物学的发展，对新物种的发现和珍稀濒危物种的保护具有重要的意义。本研究利用的基于线粒体nad1intron2序列的DNA条形码技术，排除了植物形态等条件的限制，可以直接从分子水平对金钗石斛及其近缘物种进行鉴别，效果较好。研究过程中涉及的物种序列的GC含量、遗传距离、UPGMA进化树等结果，可为石斛的市场应用提供有效的鉴别方法，为石斛类药材的鉴定提供了一种新的思路，也为找到更适合的药用植物DNA条形码，从而构建更完整的公共序列数据库奠定基础。