食用土当归有机酸成分的抑菌性研究

党凯茹，彭腾，邹和平，陈思敏，韩笑，匡宇，赵永艳

食用土当归为五加科楤木属植物食用土当归Aralia cordata Thunb.的干燥根茎及根茎，是商品九眼独活的主流品种，也是一种药食两用的传统中药[1]，食用土当归主要分布于长江流域及南山区。最早收载于《本草纲目》[2]。具有祛风活血、解热镇痛、疏风补虚、利尿消肿之功效，主要用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、头痛目眩等证[3]。研究表明[4,5]食用土当归含有皂苷、挥发油、有机酸等多种化学成分，其中有机酸主要成分贝壳杉烯酸和海松酸，具有较好的抗炎镇痛作用[6～8]。然而，未见对食用土当归有机酸成分抑菌性研究报道。因此，本研究在课题组前期研究基础上探讨食用土当归有机酸成分的抑菌性。

1 材料

1.1 试验药物

食用土当归药材，购自四川省成都市荷花池中药材市场，经成都中医药大学蒋桂华教授鉴定为五加科楤木属植物食用土当归Aralia cordata Thund的干燥根茎及根。

食用土当归中贝壳杉烯酸，海松酸，总有机酸，均由成都中医药大学药学院彭腾教授实验室提供，DMSO助溶，备用。

1.2 菌株

大肠埃希菌标准株ATCC25922一株；金色葡萄球菌ATCC25923一株；阴沟肠杆菌2012-12一株；肺炎克雷伯菌2016-1一株；表皮葡萄球菌2016-2一株；铜绿假单胞菌PAO1一株（除标准株外，其余细菌均为三级甲等医院住院患者的病理标本中分离获得的临床分离株，已由病理科鉴定纯化）。

2 方法

2.1 贝壳杉烯酸，海松酸，总有机酸的制备

食用土当归粗粉，8倍量95%乙醇加热回流提取2次，每次1 h，过滤，合并滤液，减压旋转蒸发浓缩至干，得到乙醇提取物；将乙醇提取物经硅胶柱层析法，以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，减压回收洗脱剂，再经反复重结晶，最终得到白色粉末状总有机酸，酸碱滴定法测得总有机酸含量为96%，取部分总有机酸经制备得到贝壳杉烯酸和海松酸（HPLC纯度均＞98%）。

2.2 菌株培养

将原始菌种接种于MH-A无菌固体培养基（15 mL于直径9 cm培养皿）复苏和纯化，培养条件为37℃培养24 h；取24 h纯培养物再次接种于MH-A无菌固体培养基（15 mL于直径9 cm培养皿）上，传代培养24 h，检查为纯培养物后，备用。

2.3 抑菌活性检测

2.3.1 供试品倍比浓度制备 取5个无菌冻存管，编号1号（原浓度）和2-5，分别配100%、50%、25%、12.5%、6.25%浓度药物：在1号管注入2 mL DMSO+100 mg供试品药物，吹打混匀后备用；2号管注入1 mL 1号管供试品药物+1 mL DMSO，吹打混匀后备用；3号管注入1 mL 2号管供试品药物+1mL DMSO，吹打混匀后备用；4号管注入1mL 3号管供试品药物+1 mLDMSO，吹打混匀后备用；5号注入1 mL 4号管供试品药物+1 mL DMSO，吹打混匀后备用，分别对5管混合液体用移液枪打均匀，备用。

2.3.2 抑菌圈检测 选取已经传代培养24 h 的大肠埃希菌标准株ATCC25922、金色葡萄球菌ATCC25923、阴沟肠杆菌2012-12、肺炎克雷伯菌2016-1、表皮葡萄球菌2016-2、铜绿假单胞菌PAO1分别取适量于2 mL无菌生理盐水中，调整菌液浓度为0.5 McFarland (1.5×108CFU﹒mL-1)后，再分别吸取200 µL菌液到2 mL无菌生理盐水中，用枪头打匀（菌液中浓度为1.5×107 CFU﹒mL-1）。

分别取6只无菌棉签于稀释的菌液中，蘸取适量菌液，再分别在6个相同MH-A无菌培养基上涂抹均匀（大约2 min，待菌液稍干）；在提前标号1号和2-5编号的点上，用无菌镊子放上无菌牛筋管，再在1号和2-5号无菌牛津管里分别加入200 µL的对应1号和2-5号倍比浓度药物，盖上培养皿盖，放于孵箱孵育，孵育条件37 ℃培养24 h；从孵箱中取出已培养24 h的培养皿，取下牛津管，正面拍照，再分别记录下各抑菌圈的最大直径。

3 结果

贝壳杉烯酸、海松酸、总有机酸对6种不同种细菌的抑制作用见下图1-图6。由下图可知：贝壳杉烯酸、海松酸、总有机酸对6种细菌均表现出一定的抑制作用；铜绿假单胞菌中抑菌圈直径大于大肠埃希菌、金色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌抑菌圈的直径，说明对铜绿假单胞菌的抑菌性更明显。

3.1 食用土当归有机酸成分对大肠埃希菌的抑制作用

图1 食用土当归有机酸成分对大肠埃希菌标准株的抑制效果

3.2 食用土当归有机酸成分对金色葡萄球菌的抑制作用

图2 食用土当归有机酸成分对金色葡萄球菌的抑制效果

3.3 食用土当归有机酸成分对阴沟肠杆菌的抑制作用

图3 食用土当归有机酸成分对阴沟肠杆菌的抑制效果

3.4 食用土当归有机酸成分对肺炎克雷伯菌的抑制作用

图4 食用土当归有机酸成分对肺炎克雷伯菌的抑制效果

3.5 食用土当归有机酸成分对表皮葡萄球菌的抑制作用

图5 食用土当归有机酸成分对表皮葡萄球菌的抑制效果

3.6 食用土当归有机酸成分对铜绿假单胞菌的抑制作用

图6 食用土当归有机酸成分对铜绿假单胞菌的抑制效果

4 讨论

病菌感染与人类疾病密切相关。随着化学药抗生素的广泛使用，细菌耐药性已成为全球化的问题了，滥用抗生素容易产生交叉耐药性，加之耐药性的不断增强，近几年来陆续出现了耐药性极强的“超级细菌”，“多药耐药菌”等。细菌耐药是伴随着抗生素存在的，耐药性一旦产生，耐药菌不但可通过基因传递给子代同时还会传递给其他细菌[9]。细菌耐药性对人类的危害愈发严重，且有不可抑制的趋势。

在抗生素耐药性凸显的今天，人们把更多的目光投向了来源广泛、安全性高、毒副作用小、抗耐药机制神秘的中药，希望加强对中药抗菌有效成分的研究[10]，能从中找到解决耐药性问题的新成分，故研究从传统中药中寻找抑菌和抗耐药性的成分，已成为药学领域研究的热点。

本研究采用牛津杯法从药食两用的传统中药食用土当归中提取贝壳杉烯酸、海松酸、总有机酸探讨其对6种临床常见耐药菌株大肠埃希菌标准株ATCC25922、金色葡萄球菌ATCC25923、阴沟肠杆菌2012-12、肺炎克雷伯菌2016-1、表皮葡萄球菌2016-2、铜绿假单胞菌PAO1的抑菌效应。研究结果表明：食用土当归的有机酸成分对大肠埃希菌、金色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、铜绿假单胞菌均具有一定的抑制作用，其中尤其对铜绿假单胞菌的抑制作用最强。实验为初步研究结果，对各病原菌的最低抑菌浓度( MIC) 和最低杀菌浓度( MBC)的测定还需进一步深入。

铜绿假单胞菌是一种以呼吸道为主的医院感染常见的重要病原菌之一，报道称[11]近年来其耐多药菌检出率逐渐增高，为了预防和控制铜绿假单胞菌感染的发生，在对其耐药性监测的同时也应加强对环境的整体严格消毒以及对个体的有效护理；食用土当归中的有机酸成分对铜绿假单胞菌显著的抑菌能力表明其将不仅在临床感染疾病的治疗方面发挥优势，而且在杀菌消毒产品方面有一定的研发价值。