雷公藤多苷对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织MIF及TLR4的影响

钟继红 徐磊 郑华君

[摘要] 目的 觀察雷公藤多苷对溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）小鼠结肠组织巨噬细胞游走抑制因子（MIF）和Toll样受体4（Toll-like receptor，TLR4）的影响。 方法 按照随机原则将BALB/c小鼠分为正常对照组、模型对照组和雷公藤多苷低、中、高剂量组。采用右旋葡聚糖硫酸钠法（DSS）复制BALB/c小鼠溃疡性结肠炎模型。正常对照组小鼠自由饮水，其余各组小鼠每日灌胃给药1次，连续7 d。模型对照组予生理盐水0.4 mL灌胃，不同剂量雷公藤多苷组分别以9.00、27.03和81.09 mg/kg浓度的雷公藤多苷混悬液0.40 mL灌胃，实验期间每天观察小鼠一般情况，末次给药后解剖观察，组织切片染色，光镜下观察结肠组织的病理学变化，采用ELISA酶联法检测结肠组织匀浆蛋白MIF的含量，以荧光定量PCR检测结肠黏膜TLR4 mRNA表达。 结果 模型对照组小鼠结肠组织中MIF含量和TLR4 mRNA水平较正常对照组明显上升，而不同剂量雷公藤多苷组小鼠结肠组织中MIF含量较模型对照组明显下降（P<0.01），TLR4 mRNA表达显著降低（P<0.01）。 结论 雷公藤多苷通过降低MIF含量，进而降低TLR4 mRNA表达，影响TLR4信号通路，从而达到抗溃疡性结肠炎的作用。

[关键词] 雷公藤多苷；溃疡性结肠炎；巨噬细胞游走抑制因子；Toll样受体4

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）22-0032-04

[Abstract] Objective To observe the effects of Tripterygium glycosides on the migration of macrophage migration inhibitory factor（MIF） and toll-like receptor 4（TLR4） in colonic tissue of mice with ulcerative colitis. Methods BALB/c mice were randomly divided into normal control group， model control group and low， medium and high doses of Tripterygium glycosides groups. Ulcerative colitis model of BALB/c mice was replicated by dextran sodium sulfate method （DSS）. The normal control group had free access to water， the remaining groups were administered intragastrically once a day for 7 days. The model control group was given normal saline 0.40 mL through intragastric administration. Different dose groups were given 0.4 mL of 9.00， 27.03 and 81.09 mg/kg tripterygium glycosides suspension through intragastric administration. General status of mice were observed daily during the experiment. After the last administration， we conducted anatomical observation and histological section staining to colonic tissue， and pathological changes of colonic tissue were observed under light microscope. The contents of MIF in colonic tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， and the expression of TLR4 mRNA in colonic mucosa was detected by fluorogenic quantitative PCR. Results MIF and TLR4 mRNA level in colonic tissues of model control group were significantly increased compared with those of normal control group. MIF levels in colonic tissues of different doses of tripterygium glycosides group were significantly lower than those of model control group（P<0.01）， and TLR4 mRNA expression was significantly reduced （P<0.01）. Conclusion Tripterygium glycosides can reduce MIF level， and then inhibit the expression of TLR4 mRNA and TLR4 signaling pathway， thereby achieving the effect of anti-ulcerative colitis.

[Key words] Tripterygium glycosides；Ulcerative colitis；Macrophage migration inhibitory factor； Toll-like receptor 4

UC是一种累及结肠黏膜和黏膜下层的慢性反复发作性炎症疾病，临床表现复杂多样，发病率逐年上升，预后较差。UC的发病机制中，肠道黏膜免疫调节功能紊乱，进而导致的局部持续性感染和炎症损伤被认为是重要环节[1]，而巨噬细胞移动抑制因子（MIF）和Toll样受体4（TLR4）在其中起重要作用[2，3]。既往的研究证实，UC发病的机制可能通过激活MIF进一步激活TLR4信号通路进一步引起炎症反应：细菌LPS等胞外致炎信号刺激巨噬细胞高水平表达MIF，MIF上调TLR4 mRNA的表达，经MyD88分别激活NF-κB、p38 MAPK和JNK信號通路，上调IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8，IL-17等促炎因子的表达，从而导致UC的发病[4-6]。雷公藤多苷提取自中药雷公藤，具有免疫调节作用，常用于治疗免疫系统疾病，如系统性红斑狼疮（SLE）、UC等，疗效肯定[7，8]，但其作用机制及作用靶点尚不明确，本实验拟从其对UC小鼠结肠黏膜MIF和TLR4 mRNA的影响上阐明其部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康♂SPF级BALB/c小鼠50只，体质量（20±2）g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 实验试剂与药物

DSS（ Fluka：5000MW，31404）购自Sigma公司；MIF 试剂（ELISA）购于上海西唐生物科技有限公司，批号1102261；雷公藤多苷片（10 mg/片），由浙江得恩德制药有限公司生产，批号z33020422。

1.3 实验分组及造模

所有小鼠适应性喂养3 d后开始于实验，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、模型对照组、雷公藤多苷低、中、高不同剂量组。参考文献[9]中的DSS造模方法制备慢性结肠炎模型，方法如下：除正常对照组外的小鼠自由饮用5%DSS溶液1周，然后每天观察小鼠的生活状态及大便情况。以大便带血或大便次数增多或稀便或体重减轻视为造模成功。第8天随机处死各组小鼠1只，剖腹取结肠，清洗后肉眼观察结肠充血水肿情况，并取8 cm直乙交界处肠段（甲醛固定）做组织切片，以确定造模成功。

1.4 药物混悬液配制及处理

按人-小鼠体表面积换算，分别用蒸馏水配制成低、中、高不同剂量雷公藤多苷混悬液（9.00、27.03和81.09 mg/kg）。然后每天不同剂量组各取0.40 mL混悬液分别对每只小鼠灌胃，正常对照组及模型对照组均以0.40 mL生理盐水灌胃，每天1次，连续7 d。

1.5 一般情况观察

自造模开始每日观察各组小鼠的精神状态，活动度，进食饮水情况等。称取各组小鼠的体质量，记录各组小鼠的大便情况，包括次数、形状和出血情况等。

1.6 结肠组织采集和病理学观察

治疗给药结束后，正常对照组小鼠直接采用颈部脱臼法处死，而其他4组小鼠皮下注射脂多糖（LPS），24 h后处死。取出结肠组织，冲洗干净后观察各组小鼠距肛8 cm结肠组织的大体改变，其中一部分结肠组织以10%中性甲醛溶液固定以备用，另一部分结肠组织用于制备组织匀浆，储存于-80℃备用。

1.7 MIF含量检测

取部分备用结肠组织称重，进行超声匀浆，取上清液0.1 mL，按ELISA试剂盒说明书检测MIF的浓度。

1.8 TLR4表达水平检测

结肠组织总RNA按Trizol法提取，具体参照RT试剂盒说明的步骤。

1.9 统计学方法

应用SPSS19.0统计软件，计量资料以（x±s）表示，两两比较采用LSD-t检验及Dunnett-t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

模型对照组小鼠出现活动减少，反应迟钝，竖毛，毛色失去光泽，凌乱，大便不成形，夹有血便及黏液便，次数增多，体质量减轻。低、中、高剂量雷公藤多苷组的上述症状较模型对照组减轻。正常对照组小鼠活泼，体质量、毛色、胃口及大便均正常。

2.2 各组小鼠结肠组织病理学改变

模型对照组：镜下可见小鼠结肠组织明显充血水肿，见破碎的细胞和腺体，层次不清，另见大量中性粒细胞细胞浸润，黏膜浅溃疡形成；低剂量雷公藤多苷组：镜下可见结肠组织水肿仍较明显，大量炎性细胞浸润，黏膜仍有散在浅溃疡；中剂量及高剂量雷公藤多苷组：镜下可见结肠组织水肿和充血基本消失，炎性细胞浸润明显减少，另可见已愈合的溃疡组织；正常对照组：光镜下可见结肠黏膜光滑完整，腺体清晰、层次清楚，未见中性粒细胞等炎性细胞浸润等（封三图4）。

2.3 各组小鼠结肠组织的MIF含量

正常对照组小鼠结肠组织中MIF含量均低于模型组和不同剂量雷公藤多苷组（P<0.01），模型对照组高于不同剂量雷公藤多苷组，而不同剂量雷公藤多苷组中，低剂量组高于中剂量组，高于高剂量组。见表1。

2.4 各组小鼠结肠组织TLR4 mRNA的表达水平

TLR4 mRNA表达水平在模型对照组和不同剂量雷公藤多苷组较正常对照组均有不同程度的升高，且不同剂量雷公藤多苷组的TLR4 mRNA表达水平较模型对照组显著降低（P<0.01），但中剂量雷公藤多苷组与高剂量雷公藤多苷组与正常对照组TLR4 mRNA表达水平差异无统计学意义（表1）。

3 讨论

溃疡性结肠炎病因病机尚不明确，好发于年轻人，病程慢性迁延，反复发作，临床治愈率低，给社会生产力和个人生活质量带来极大影响[10]。当前临床上常用水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂治疗UC，但在UC缓解期治疗时，药物的可选择性小，同时存在不良反应多，难以坚持用药，经济负担重等缺点，造成患者的依从性低，从而引起疾病的复发。传统中医学认为UC属于“痢疾”、“泄泻”、“肠风”、“下利”等范畴，其基本病机是脾虚湿盛，健脾化湿为其治疗大法。中药在长期维持治疗中有不良反应少、经济压力小等优势。雷公藤多苷是从中药雷公藤中提取出来的有效成分，具有抑制免疫的作用。刘端勇等[11]研究发现：对于慢性炎症性肠病模型小鼠采用雷公藤多苷治疗有较好的疗效，但确切的机制尚不清楚。钟继红等[12]研究发现雷公藤多苷可通过TLR4信号通路作用于UC模型小鼠，但具体的作用靶点有必要进一步深入，从而为下一步的临床应用提供理論依据。

MIF是一种具有多种生物功能的前炎症因子，最初发现是在活化的T淋巴细胞中，故T淋巴细胞是MIF的重要来源之一。大量报道显示在UC的发病过程中，MIF发挥了重要的作用，其主要抑制巨噬细胞的游走，促使活化免疫细胞和巨噬细胞分泌多种炎症因子，参与免疫与炎症疾病的进展[13]。王柏涛等[14]研究发现，使用抗MIF单抗的UC小鼠与UC模型组小鼠比较，小鼠的粪便性状、体重减轻幅度、结肠的大体表现及光镜下黏膜改变等均有显著改善，应用免疫组化染色法观察 MIF、TNF-α、IL-6等促炎因子，发现其表达也不同程度的下降，进一步证明抗MIF单抗对小鼠UC的发病的确能起到保护作用。易文等[15]研究发现，UC模型小鼠结肠组织中 MIF表达显著升高，而光镜下发现结肠黏膜层变薄，黏膜下层局部充血水肿、伴有大量炎细胞浸润，淋巴细胞散在分布。采用中药经方四逆散治疗后能显著改善上述异常变化。唐光耀等[16]实验发现：抗MIF单抗能有效地减轻DSS诱导的急性UC小鼠的外在表现及结肠大体及组织的损伤，有一定的治疗作用，对UC小鼠有一定的保护作用，从侧面显示了MIF在UC致病中的作用。

TLRs是启动炎症反应及免疫应答的重要模式识别受体 ，通过快速而准确的感知及识别机体“自我”及“非我”的保守分子模式PAMPS以激活天然免疫系统，同时作为预警信号，向抗原递呈细胞（antigen presentcen，APC）发出警报，从而激活T细胞而启动获得性免疫系统[17]。LPS/TLR4在机体免疫反应中的重要作用得到众多学者的公认，近来TLR4也被认为是肠道免疫反应的一类关键介质，TLR4 mRNA在正常的结肠黏膜中呈现低表达，而在UC的结肠黏膜中则呈现异常的高表达[18-19]。赵承满等[20]证实乌司他丁能减轻溃疡性结肠炎大鼠肠道炎症反应，其机制可能与通过下调TLR4 mRNA及NF-κB的表达，减少炎症因子TNF-α的释放有关。

本研究成功复制了小鼠慢性结肠炎的模型，该模型广泛应用于UC免疫病理机制的研究，同时用于评估新药的疗效。该模型小鼠结肠主要表现为黏膜广泛充血水肿糜烂，腺体紊乱，层次不清，浅溃疡形成，同时伴有中性粒细胞和淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，符合人类溃疡性结肠炎的病理改变。本研究结果表明：雷公藤多苷能有效治疗DSS诱导的小鼠结肠炎症，主要表现在治疗组小鼠结肠组织中MIF和TLR4 mRNA表达水平显著降低，与模型对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01），从研究结果可以得出结论：雷公藤多苷抑制结肠组织中MIF和TLR4 mRNA的表达可能是其治疗UC的作用靶点。

[参考文献]

[1] Hanauer SB.Inflammatory bowel disease：Epidemiology，pathogenesis and therapeutic opportunities[J].Inflamm Bowel Dis，2006，12（1）：S3-9.

[2] Grieb G，Merk M，Bernhagen J，et al.Macrophage migration inhibitory factor（MIF）：A promising biomarker[J].Drug News Perspect，2010，23（4）：257-264.

[3] Soares JB，Pimentel Nunes P，Roncon Albuquerque R，et al.The role of lipopolysaccharide/toll-like receptor 4 signaling in chronic liver diseases[J].Hepatol Int，2010，4（4）：659-672.

[4] Ip YT，Davis RJ.Signal transduction by the C-Jun-N-Terminal Kinase（JNK） from inflammation to development[J].Curr Opin Cell Biol，1998，10：205-219.

[5] Zhang DY，Chen LL，Li SL，et al. Lipopolysaccharide（LPS）of porphyromonas gingivalis induces IL-1B，NF-A and IL-6 production by THP-1 cells in a way different from that of escherichia coli LPS[J]. Innate Immun，2008， 14（1）：99-107.

[6] Dai JN，Zong Y，Zhong LM，et al. Gastrodin inhibits expression of inducible no synthase，Cyclooxygenase-2 and proinflammatory cytokines in cultured Lps-stimulated microglia via mapk pathways[J]. PLoS One，2011，6：e21891.

[7] 王坤明，來旭华，郑伟明，等.雷公藤多甙治疗溃疡性结肠炎临床研究[J].实用中医内科杂志，2005，19（4）：336.

[8] 冯胜刚. 雷公藤多甙对细胞免疫和临床肾脏病免疫的影响[J].西部医学，2003，1（4）：367.

[9] Stevceva L，Pavli P，Husband AJ，et al. The inflammatory infiltrate in the acute stage of the dextran sulphate sodium induced colitis：B cell response differs depending on the percentage of DSS used to induce it[J]. BMC Clin Pathol，2001，1：3.

[10] 中华医学会消化病分会炎症性肠病协作组.中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J].中华内科杂志，2008，40（1）：73-79.

[11] 刘端勇，赵海梅，程绍民，等. 雷公藤多苷对结肠炎小鼠外周血CD40/CD40L表达的影响[J].中药药理与临床，2012，28（1）：94-97.

[12] 钟继红，王章流，刘英超，等.雷公藤多苷对溃疡性结肠炎小鼠结肠黏膜TLR4信号通路表达的影响[J].中国中西医结合消化杂志，2015，23（5）：307-310.

[13] Lue H，Kleemann R，Calandra T，et al. Macrophage migration inhibitory factor（MIF）：Mechanisms of action and role in disease[J].Microbes Infect，2002，4（4）：449-460.

[14] 王柏涛，张启芳，邱小芬，等.抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对溃疡性结肠炎小鼠发病的干预机制研究[J].安徽医科大学学报，2016，51（1）：31-35.

[15] 易文，覃慧林，石孟琼，等.四逆散对溃疡性结肠炎小鼠 NF-κB 激活及MIF和细胞因子表达的影响[J].中药材，2015，38（7）：1476-1480.

[16] 唐光耀，张启芳，王柏涛，等.抗巨噬细胞移动抑制因子单抗对结肠炎小鼠结肠 NF-κB、IκB表达的影响[J].微创医学，2017，12（2）：170-174.

[17] Takeda K，Kaisho T，Akira S. Toll-Like Receptors[J]. Annu Rev Immunol，2003，21：335-376.

[18] Miyake K.Innate recognition of lipopolysaccharide by Toll-Like Receptor 4-Md-2[J].Trends Mierobiol，2004， 12：186-192.

[19] Kumar H，Kawai T，Akira S.Toll-like receptor sand inflate immunity[J]. Biochem BioPhys ResCommun，2009，388：621-625.

[20] 赵承满，孟立娜，陈锦龙，等.乌司他丁对溃疡性结肠炎大鼠结肠炎症及TLR4/NF-κB信号通路的影响[J].中国现代应用药学，2017，34（3）：347-351.

（收稿日期：2018-03-22）