糖肾康方对db/db小鼠糖脂代谢及肾脏组织病理的影响

张东鹏，张定华，史晓伟，刘怡，裴文丽

甘肃省中医院内分泌科，甘肃 兰州 730050

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的难治性慢性并发症之一。在发达国家和地区，DN已成为终末期肾脏疾病的第一位病因(约占35%)和因患糖尿病死亡的主要原因，在我国DN患者也逐年增长[1～3]。DN属中医学水肿、尿浊、胀满、关格、肾消等范畴。DN是由于糖尿病(消渴病)迁延不愈，耗伤肾气，湿浊瘀阻所致。其主要病位在肾，但与肝、心、脾、肺多脏腑密切相关[4～6]。张定华等[7]认为“肾气亏虚、湿浊瘀阻”为DN的主要病机特点，提出“补肾益气、通络化浊”法，确立治疗DN的中药组方糖肾康方(TSK)，其前期研究发现TSK含药血清能够抑制肾小球系膜细胞增殖，高糖诱导的肾小球系膜细胞中Cx43 mRNA表达下降，DAG mRNA、IP3 mRNA和PKC mRNA呈高表达，TSK治疗后Cx43 mRNA表达升高，DAG mRNA、IP3 mRNA和PKC mRNA表达均下降。

db/db小鼠是因位于小鼠4号染色体上的瘦素受体基因突变导致瘦素缺乏的先天肥胖性2型糖尿病小鼠。db/db小鼠8周龄时出现明显高血糖，12～14周龄出现肾小球肥大、系膜细胞增宽、肾小球基底膜增厚，是目前国际公认的糖尿病肾病动物模型。本研究将观察TSK对db/db小鼠的血脂、血糖、24 h尿蛋白及肾组织病理的影响，探讨TSK对其肾脏保护作用的可能机制，为TSK的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物 杜仲、黄芪各30 g(甘肃康乐药业有限公司)，芡实、泽泻(兰州方正医药有限公司)、金樱子(甘肃雍合堂药业有限公司)各20 g，大黄(甘肃雍合堂药业有限公司)、水蛭(甘肃康乐药业有限公司)各10 g，桃仁(兰州方正医药有限公司)15 g，所有饮片均购自甘肃省中医院门诊草药房(鉴定人：李继文；质控状态：标准)。将以上药物按原方比例常规煎煮、过滤、水浴蒸发，制成TSK，按成人与小鼠体表面积折算的等效剂量(等效系数：6.25)为中剂量[8]，该组方已申请国家专利，专利证号：ZL201210311984.6。药物经过常规煎煮、过滤、水浴蒸发至含生药材2.21 g/mL，每组小鼠按10 mL/kg灌胃，70 kg成人每天服用生药155 g，按体质量换算后小鼠等效灌胃量为22.14g/(kg·d)，灌药浓度即2.21 g/mL，置于4℃冰箱保存备用。罗格列酮钠片(规格：4 mg×15片/盒，由太极集团重庆涪陵制药厂有限公司提供，批号：15090049)。

TSK低、中、高剂量组给药量为成人剂量的5倍、10倍、20倍，每组小鼠按10 mL/kg灌胃，实验中TSK低、中、高剂量组具体灌胃剂量分别为11.07、22.14、44.28 g/(kg·d)，模型组灌服相同体积0.9%的生理盐水，每天1次，连续12周，空白组不做其他处理。

1.2 实验动物 12周龄SPF级雄性db/db小鼠100只，由南京大学动物模式研究所提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2016－1124。随机分为空白组、模型组、TSK高、中、低剂量组，每组20只，共5组。

1.3 观察小鼠一般状况，检测体质量和随机血糖 灌胃12周后，股动脉采血，分离血清，-20℃保存。取各组db/db小鼠肾脏组织，置于4%多聚甲醛中固定，液氮储存，备检。

1.4 各组小鼠肾脏病理组织变化及各检测指标测定 免疫荧光多重标记后，在电子显微镜下观察小鼠肾脏病理切片。用全自动生化分析仪检测血糖、甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。各组分别用代谢笼收集24 h尿液，并记录尿量，离心尿液后取上清液，-20℃储存，采用双缩脲法测定大鼠24 h尿蛋白定量。肾组织切片，过碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain，PAS)染色法染色，每张切片从肾皮质外侧向内，自上而下随机取2个(×40)视野，在电子显微镜下观察小鼠肾脏病理切片。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况 空白组小鼠精神状况良好，毛色光泽，活动自如，反应灵敏，摄食、饮水正常；其余各组小鼠精神萎靡，反应迟钝，嗜卧、懒动。随实验进程，空白组小鼠一般状态未见明显变化；模型组小鼠精神萎靡，毛色晦暗无光泽，懒动；TSK低、中、高剂量组上述症状较模型组均有不同程度的改善，以TSK高剂量组改善最为显著。

2.2 各组小鼠体质量检测结果比较 见表1。治疗前，与空白组比较，模型组小鼠体质量显著增加(P＜0.05)；与模型组比较，TSK低、中、高剂量无显著差异。治疗后，与空白组比较，模型组小鼠体质量显著增加(P＜0.05)；与模型组比较，TSK中、高剂量组体质量减小(P＜0.05)。

表1 各组小鼠体质量检测结果比较 g

2.3 各组小鼠血糖检测结果比较 见表2。与空白组比较，模型组小鼠血糖显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，TSK高剂量组血糖显著下降(P＜0.05)。

表2 各组小鼠血糖检测结果比较 mmol/L

2.4 各组小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C检测结果比较 见表3。与空白组比较，模型组小鼠TC、TG、LDL-C显著升高，HDL-C显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，TSK中、高剂量组TC、TG、LDL-C显著降低，HDL-C显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表3 各组小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C检测结果比较 mmol/L

2.5 各组小鼠24 h尿白蛋白检测结果比较 见表4。与空白组比较，模型组小鼠24 h尿白蛋白显著升高(P＜0.05)；与模型组比较，TSK高剂量组第2、4、6、8周和中剂量组第6、8周及低剂量第8周24 h尿白蛋白显著降低(P＜0.05)。

表4 各组小鼠24 h尿白蛋白检测结果比较 mmol/L

2.6 各组小鼠肾脏病理改变结果 见图1。PAS染色，空白组小鼠肾小球结构完整，系膜区、基底膜未见明显异常，TSK低剂量和中剂量组小鼠肾小球体积增大，系膜基质增生、基底膜增厚明显，部分小球出现分叶，TSK高剂量组小鼠系膜基质增生及基底膜增厚显著改善，系膜基质百分比显著降低。

图1 各组小鼠肾脏病理改变结果（×400）

3 讨论

肾小球硬化是DN晚期的主要病理表现，活化后的肾小球系膜细胞异常增生，释放多种炎症介质，如白细胞介素-1、白细胞介素-6等，促进细胞外基质的积聚，肾小球逐步硬化，而细胞外基质的合成和降解异常加剧了这一过程的发生[9～10]。同时，脂代谢紊乱在糖尿病病程的发生、发展过程中发挥了很重要的作用[11]。因此，DN患者不仅血糖异常，脂代谢也紊乱。在治疗过程中，降糖的同时要保证血脂在比较理想的范围内，以延缓并发症的发生。

张定华等[13]结合前人的理论和自己的多年临床及实验研究，认为“肾气亏虚，湿浊瘀阻”为DN基本病机，针对这一病机，以“补肾益气、通络化浊”为治法，筛选组方，不断优化，确定了TSK的组方。方中杜仲补中，益精气，坚筋骨，补益先天之肾精，黄芪补益中土，温养脾胃，补益后天之气，与杜仲相配，达到先后天同补，固摄精气、消除尿中蛋白之效；水蛭、大黄、桃仁相伍，取桃仁承气之意，化瘀通络，治疗下焦瘀热互结；金樱子与芡实相配，取水陆二仙丹之意，进一步固肾涩精、缩尿止遗，加强固摄之效，协助减少尿中蛋白；另加一味泽泻，利水，渗湿，泄热，通调水道，下输膀胱，使补而不滞。全方先后天同治、气精同补、补消相配，起到补肾益气、通络化浊之效，达到消除蛋白、降糖、调脂之临床疗效。方中采用虫类药也是一大特点，虫类入络搜剔，有攻冲之性，善入细微孔隙。水蛭“主逐恶血、瘀血、月闭、破血瘕积聚、利水道”。现代药理学研究提示水蛭中含有水蛭素等多种活性多肽，具有调血脂、抗血栓等作用[12]，近年来较多文献报道单独应用水蛭可以降低尿蛋白，减轻肾脏病变[7]。本实验中，TSK中、高剂量组，明显可以减少24 h尿白蛋白，调节血脂，协助降血糖，明显减轻肾小球系膜基质增生及基底膜增厚。其原理与影响血脂、血糖代谢有关，同时可能通过促进过度增殖细胞凋亡而实现对DN的治疗作用[13]。