丽格海棠叶片快速繁殖技术的优化

胡燕梅，向鹏飞，李凯鹏

（1.江汉大学 期刊社，湖北 武汉 430056；2.武汉生物工程学院 生命科学与技术学院，湖北 武汉 430415）

丽格海棠（begonia×elatior）为秋海棠科秋海棠属多年生草本花卉，是球根秋海棠和野生秋海棠的杂交品系。丽格海棠株形丰满，花形和玫瑰相似，故又名玫瑰海棠。其花色丰富，花朵硕大，色彩艳丽。我国20世纪90年代从国外引进该品种，近年来在国内发展很快，目前是国际花卉市场上非常畅销的盆花之一［1］。丽格海棠一般不形成种子，多采用扦插繁殖。其扦插繁殖主要采用叶插和茎插为主，但是扦插过程中很容易烂根，且繁殖速度较慢，不能满足市场需要［2-3］。植物组织培养技术能够快速繁殖优质种苗，在一定程度上可以满足市场需求，目前已广泛应用于观赏植物的种苗生产［4-7］。本试验以丽格海棠的幼嫩叶片为材料，进行体外再生培养，优化丽格海棠快速繁殖体系，以期为其工厂化育苗打下基础。

1 材料与方法

1.1 无菌材料的获得

丽格海棠采购于武汉林业有限责任公司。选取生长健壮的丽格海棠作为母株材料，摘取植株上已平展的幼叶，用含少量洗衣粉的清水洗约2 min，洗净后流水冲洗30 min，置超净工作台上酒精处理30 s，然后放入0.1%的升汞溶液中浸泡消毒8 min，再用无菌水冲洗5～6次后取出。用无菌滤纸将材料吸干，用解剖刀先切去叶片的边缘后将叶片切成1 cm2的小片，每片最好带有叶脉，然后通过无菌操作进行接种，接种材料的培养条件为：温度23～27℃，光照度1 000～2 000 lx，光照周期12～14 h/d。

1.2 不定芽的诱导

1.2.1 基本培养基对叶片不定芽分化的影响 将消毒好的外植体叶片接种于基本培养基MS、N6和B5中，每种基本培养基中加 1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30 g/L 蔗糖 +8g/L 琼脂，pH5.8。每个处理接种18个外植体。培养45 d后统计有效接种数、分化不定芽的有效接种数、分化的不定芽数、有效不定芽数（叶柄长度和叶片直径超过1 cm的不定芽），并计算不定芽分化率和不定芽分化系数。

有效接种数：接种后没有污染的外植体叶片数；

分化率＝（分化不定芽的外植体叶片数/有效接种数）×100%；

不定芽分化系数＝分化的不定芽数/有效接种数；

有效不定芽分化系数＝有效不定芽数/有效接种数。

1.2.2 6-BA与两种生长素对叶片不定芽分化的影响 以MS+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂为基本培养基，6-BA设5个梯度，分别为：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，NAA和IBA浓度为0.1 mg/L。将消毒好的外植体叶片接种到这10组培养基中，每个处理接种18个外植体。

后续试验又以细胞分裂素6-BA浓度1.0 mg/L为基础，生长素IBA和NAA设3个梯度，分别为：0.1、0.2、0.3 mg/L，检测两种生长素不同的3个浓度对不定芽分化的影响。

培养45 d后统计有效接种数、分化不定芽的有效接种叶片数、分化的不定芽数、有效不定芽数，并计算不定芽分化率和不定芽分化系数。

1.2.3 培养基介质对不定芽芽团增殖的影响 1.2.2培养过程中有大量不定芽芽团形成，在实际生产中这些芽团由于不定芽过于密集而不能单独作为种苗加以利用而被废弃，增加了生产成本。本试验中将直径约1 cm的不定芽芽团接入不同培养基的培养介质中，以探讨不定芽芽团继续生长的效果。

以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖为培养基，设计不同培养介质为：滤纸（2层）、纱布（4层）、棉花（厚度0.5 cm）、液体培养基，以8 g/L琼脂作为对照并记为CK。选取1.2.2中直径约1 cm的芽团作为外植体进行接种，以检测5种介质对芽团后期长势的影响，每个处理接种10个外植体，培养45 d后统计芽团直径、有效芽增殖数，计算芽团增殖倍数和有效芽增殖系数。

芽团增殖倍数=45 d后芽团直径/接种前芽团直径；

有效芽增殖系数=有效芽增殖数/接种的芽团数。

1.2.4 蔗糖对不定芽芽团增殖的影响 选取1.2.2中直径约1 cm的芽团作为外植体，分别接种到蔗糖浓度为10、15、20、30、40 g/L的培养基中，以检测不同浓度蔗糖对不定芽芽团生长的影响。每个处理接种10个外植体，培养45 d后统计芽团直径、有效芽增殖数，计算芽团增殖倍数和有效芽增殖系数。

1.3 不定根的诱导

1.3.1 IBA和NAA分别对不定根诱导的影响 以1/2 MS+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂为基本培养基，选取1.2中长势健壮的不定芽为接种材料，分别接种于IBA和NAA不同浓度的生根培养基中。每个处理接种18个不定芽，培养45 d后统计分化不定根的材料数、不定根的诱导总数，计算生根率和生根系数。

生根率＝（分化不定根的材料数/有效接种数）×100%；

生根系数＝不定根的诱导总数/有效接种数。

1.3.2 活性炭对不定根诱导的影响 以1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂为生根培养基。选取1.2中所获得的长势健壮的不定芽为外植体，分别接种于活性炭（AC）不同浓度的生根培养基中。每个处理接种18个外植体，培养45 d后统计结果并计算生根率和生根系数。

1.3.3 PP333对不定根诱导的影响 以 1/2 MS+0.1mg/L NAA+30g/L 蔗糖+8 g/L 琼脂为基本生根培养基。选取1.2中所获得的长势健壮的不定芽为外植体，分别接种于多效矬（PP333）不同浓度的生根培养基中。每个处理接种18个外植体，培养45 d后统计结果并计算生根率和生根系数。

1.4 试管苗炼苗移栽

选取长势健壮并且均匀一致的单芽试管苗，松动封口膜3 d后打开封口膜，5 d后用无菌水洗净根部培养基，分别移栽于炼苗基质中。3种炼苗基质成分为：Ⅰ号基质为泥炭土∶珍珠岩=5∶2；Ⅱ号基质为泥炭土∶珍珠岩∶锯末 =3∶1∶1；Ⅲ号基质为泥炭土∶锯末=1∶1。

3种炼苗基质均经过高温灭菌，每种处理移栽10株试管苗，隔天上午喷水。炼苗条件为：温度23～27 ℃，光照度1 000～2 000 lx，光照周期12～14 h/d。

定期观察，统计结果，计算成活率。

2 结果与分析

2.1 不定芽的诱导

2.1.1 基本培养基对叶片不定芽分化的影响 幼嫩叶片在3种培养基上培养20 d后少量叶片的切口处变厚，有翠绿色芽点出现。继续培养叶片边缘的芽点形成明显小芽，后期更多叶片上直接分化出大量不定芽（图1）。培养45 d后统计分化率及分化系数，结果见表1。

图1 外植体叶片上分化不定芽Fig.1 Adventitious bud differentiation on explant leaves

表1 基本培养基对叶片不定芽分化的影响Tab.1 Effects of basic mediums on adventitious bud differentiation of leaves

从表1可以看出MS基本培养基诱导叶片分化不定芽的效果明显优于B5和N6，其分化率达到100%，分化系数达到了10.8，且有效芽分化系数较高，达到了4.6。分化出的新芽叶片长势良好，叶片嫩绿肥大，叶柄长且粗。N6培养基的分化率为72.9%，分化系数达到8.7，且有效芽数较少，有效芽分化系数仅1.5，其不定芽长势也不理想，叶柄细长、叶片较小。B5培养基在前15 d长势超过了MS和N6，但是其不定芽的叶柄粗短，不定芽数量多而密集成簇，且在培养后期叶片开始枯黄。综上所述，本试验选择MS为适宜基本培养基。

2.1.2 6-BA与两种生长素对丽格海棠叶片不定芽分化的影响 将丽格海棠的幼嫩叶片切块接种到不同浓度6-BA和两种生长素NAA及IBA的培养基上生长培养45 d后统计试验结果见表2和表3。

表2 不同浓度6-BA与两种生长素组合对不定芽分化的影响Tab.2 Effects of combination of 6-BA with different concentrations and two auxins on adventitious bud differentiation

表3 6-BA与两种不同浓度生长素组合对不定芽分化的影响Tab.3 Effects of combination of 6-BA and two auxins with different concentrations on adventitious bud differentiation

从表2可以看出6-BA浓度相同时NAA处理在分化率和分化系数两个指标上均较IBA处理效果更好，表明生长素NAA更适合于丽格海棠叶片分化出不定芽。但在NAA处理上，随着6-BA的浓度由0.5 mg/L增加到2.5 mg/L时，分化率和分化系数均出现了先上升后下降的趋势，其中1.0mg/L的6-BA处理效果最好，分化率为100%，分化系数为10.7，有效芽分化系数达到4.4。6-BA浓度较低时分化出的新芽长势较正常，新芽叶片宽大，叶柄长，后期随着6-BA浓度升至2.0 mg/L时有效芽分化系数为0，分化出的新芽长势较差，叶柄短、叶片小，新芽簇生成团状（图2），很多无法进行后期继代培养和生根培养。所以选择1.0 mg/L 6-BA为最适细胞分裂素浓度。

图2 簇状的不定芽芽团Fig.2 Cluster of adventitious buds

从表3可以看出培养基中只添加细胞分裂素6-BA而不加生长素时叶片均枯死，表明生长素对于丽格海棠叶片诱导不定芽起着重要作用，即没有生长素会导致叶片直接枯死。NAA和IBA为0.1 mg/L时，不定芽的叶柄粗短，平均长度在0.5 cm左右，叶片较小，平均大小只有0.7 cm2。随着IBA的浓度由0.1 mg/L增加到0.2 mg/L时，IBA的分化率由82.6%达到了84.3%，分化系数由4.7达到了8.2。但NAA处理组的分化率均达到了100%，分化系数最高达到11.8，明显优于IBA。但当NAA和IBA为0.3 mg/L时，虽有大量不定芽分化，但是不定芽生长成球状，几乎无叶柄的生成，叶片呈尖三角形状，而与正常圆形叶片差异较大（图2），说明高浓度的生长素虽能促进不定芽分化，但能获得的有效芽却很少。综上所述：生长素的种类以NAA为好，浓度以0.2 mg/L适宜。

2.1.3 培养基介质对不定芽芽团生长的影响 将不定芽芽团接种到不同介质的培养基中培养，其对不定芽芽团吸收营养的快慢和生长程度影响各不相同。培养第15天时无介质的培养基即液体培养基上芽团最先生长，体积膨大，并伴随部分叶片开始张开成圆形，有叶柄生成。后期培养棉花、纱布为介质的培养基上也出现以上现象，琼脂和滤纸的生长效果相对较差。45 d后的生长情况统计见表4。

表4 培养介质对不定芽芽团生长的影响Tab.4 Effects of mediums on growth of adventitious buds

由表4可知，接种的不定芽芽团培养45 d后体积均有较大增加。其中液体培养基芽团增殖倍数最大，达到5.6倍，有效芽增殖系数达到8.6。表明液体培养基不加任何介质更适于不定芽芽团生长获得有效芽，能为后期生产提供更多芽苗，且成本更低廉，建议生产中若出现了不定芽芽团，可以以液体培养基继续培养以获得更多有效芽。

2.1.4 蔗糖对不定芽芽团生长的影响 将不定芽芽团接种到不同蔗糖浓度的液体培养基中培养10 d后，20 g/L蔗糖处理组最先出现明显的体积膨大，叶柄增长，叶片变宽大。30 d后其他处理也开始有明显的体积膨大。45 d后统计结果（见表5）。

表5 蔗糖对不定芽芽团生长影响Tab.5 Effects of sucrose on growth of adventitious buds

从表5可知，不定芽芽团在蔗糖浓度为40 g/L时芽团的增殖效果最好，增殖倍数达到6.2，但有效芽增殖系数却仅有3.6，可能是蔗糖浓度过高，营养过于丰富，利于整个芽团生长而不利于单个有效芽抽出。而低浓度的蔗糖培养基上芽团虽有生长，但均不及30 g/L蔗糖处理组的不定芽芽团的增殖倍数及有效芽增殖系数。

2.2 生根的诱导

2.2.1 IBA和NAA分别对不定根诱导的影响 将约2 cm高的健壮芽接到生根诱导培养基中进行生根培养，20 d后部分芽有少量根萌发，后期大量不定根生长的同时大量芽也长势旺盛，培养45 d后统计生根情况（见表6）。

表6 生长素对不定根诱导的影响Tab.6 Effects of auxins on inducing of adventitious roots

从表6结果可以看出培养基中不加生长素，生根率为0，且芽的长势较差。但加入生长素后，生根率普遍提高，表明丽格海棠自我生根能力较差。在NAA与IBA组合中，当NAA浓度相同时，随着IBA浓度增加，不定根的生长情况越差；整体来说以NAA浓度为0.1 mg/L时效果最佳，尤其在单独添加0.1 mg/L NAA的处理中，其生根率高达100%，生根系数也达到8.6，而且芽的长势也非常旺盛。可见两种生长素使用中，NAA效果明显好于IBA。

2.2.2 活性炭对丽格海棠生根的影响 将不定芽接种到不同浓度活性炭的诱导培养基中进行生根培养，定期观察。对照组即不添加活性炭的处理组不定芽有大量根出现，且芽长势旺盛。培养45 d后统计生根情况（见表7）。

表7 活性炭对不定根诱导的影响Tab.7 Effects of activated carbon on inducing of adventitious roots

从表7中可以看出没有加入活性炭的对照组的生根率和生根系数均最好，表明活性炭对不定根的诱导无促进作用。由于光可诱发培养基中植物激素的降解，而活性炭的添加削弱了试管苗基部的光照强度［8］，所以活性炭提供的暗环境可保证植物生长所需的调节物质的结构稳定性与活性。但同时活性炭可能对激素有吸附作用，所以高浓度的活性炭会影响试管苗对植物激素的利用［9］。本试验结果显示活性炭添加对不定根生长不仅无促进作用，反而有抑制作用，说明其对促进不定根形成的生长素NAA有较强的吸附作用。

2.2.3 PP333对不定根诱导的影响 将不定芽接到含有不同浓度PP333的不定根诱导培养基中进行生根培养，培养45 d后统计生根情况（见表8）。

表8 PP333对不定根诱导的影响Tab.8 Effects of PP333on inducing of adventitious roots

从表8中可以看出0.1 mg/L PP333处理组不定芽的生根率和生根系数均和对照没有明显差异，但从长势来看该处理组的试管苗根变粗，小苗粗壮，说明PP333有利于丽格海棠试管苗的整体长势，可以为后期的炼苗移栽提供较好的基础材料来源。这与吕文涛等［10］的研究结果一致。

2.3 试管苗炼苗移栽

丽格海棠试管苗分别移栽入3种炼苗基质中生长，定期观察，统计成活率（见表9）。

表9 试管苗的成活率Tab.9 Survival rate of test tube seedlings

从表9可以看出Ⅰ号基质处理的成活率最高，所以泥炭土与珍珠岩比例为5∶2时适宜作为试管苗移栽的基质。且从表中可以看出，第5天到第10天小苗的成活率普遍下降很快，而过了这个时期又趋于平缓。说明移栽苗的存活能力在5～10 d有一个临界期，跨越这个临界期后试管苗存活的概率增加，这与贾清华等［11］的研究结果一致。

3 讨论

由于丽格海棠在自然界的扦插繁殖主要采用成熟叶片进行，也就是说叶片是其自然繁殖的主要器官，所以在进行丽格海棠的离体培养时首选外植体部位为其幼嫩叶片。

植物快繁过程中培养物的增殖方式有多种，其中常见的有丛生芽增殖方式［12］、不定芽增殖方式［13］、原球茎增殖方式［14］和愈伤组织增殖方式［15］，而丽格海棠的叶片主要是不定芽增殖方式，即从叶片上直接分化出大量的不定芽，绕过了愈伤组织阶段，这样对快速繁殖体系的建立可以节约大量时间。

本试验结果表明不同的基本培养基在不同的时间段会有不同的试验效果，在前15 d，B5培养基较MS和N6能够使叶片更快分化不定芽，但是到15 d后B5培养基中的试验苗普遍出现了枯萎的现象，其中原因还有待研究。MS培养基中的不定芽生长健康，叶柄、叶片比N6培养基中的不定芽更加粗壮和茂盛，则在本试验中选择MS为适宜基本培养基。

李玲［16］采用0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 激素组合，在此条件下，不定芽的茎生长较快，但较细长，存在失绿的现象。采用1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA时，其茎生长粗壮，30 d后开始展出绿色小叶，45 d形成小植株体。可见增殖养基中激素配比以1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA比较适宜。这与本试验结果一致，培养基中要有适当的生长素存在和细胞分裂素起协同效应才能更好地刺激不定芽的分化。王海朋等［17］发现培养基中无生长素时大量的丽格海棠‘宣言’品种的外植体叶片枯黄和死亡，与本试验中NAA和IBA为0 mg/L时所有叶片均枯死的试验现象是一致的，证明生长素对叶片的生长有重要作用。随着生长素浓度的增加分化系数也增加，当生长素的浓度达到0.3 mg/L时，分化的不定芽成球状，几乎无茎和叶柄出现，或者叶柄很短。可见前期生长素的浓度筛选设计在0.1～0.3 mg/L是可行的。李晓东等［18］发现丽格海棠叶片进行不定芽增殖的同时伴有根系生成，说明丽格海棠含有一定量的内源生长素，而在本试验过程中没有发现此现象，可能是由于试验材料所选丽格海棠品种不同所致。芽团生长试验表明直接将芽团接入液体培养基中利于芽团有效芽的生长，为生产中大量不定芽的后续利用提供了可能，否则不定芽芽团将有可能直接废弃，增加了生产成本。

丽格海棠组培苗对生根培养基中的激素质量浓度要求也较为严格，最适宜的生根培养基为1/2 MS+0.1 mg/L NAA，其生根率高达100%。即在培养基中单独加入NAA而不加6-BA也能很好地诱导不定根的形成。但并非NAA的使用浓度越高效果就越好，即需要适宜浓度。潘梅等［19］的研究表明根数和生根率同激素质量浓度呈现不均匀的变化，根的粗壮程度与激素质量浓度的增加并无规律性的变化，当激素质量浓度超过一定范围，生根数目相对较少，根的分化效果也不理想，而且有大量愈伤组织形成。这一结果与本试验结果有相似之处，说明NAA适宜浓度的选择对生根效果的影响是很大的。培养基中添加活性炭不利于生根，但多效矬处理却生根效果明显，且芽苗更粗壮，利于后期炼苗移栽。