野生冬虫夏草与人工冬虫夏草蛋白质组差异研究

王艺璇，王芳，张涵，童芯锌，陈璐，彭成，国锦琳

冬虫夏草Ophiocordycepssinensis为麦角菌科冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的干燥复合体。具有“补肾益肺，止咳化痰”之功效，长期以来被视为珍贵的补益类中药。[1]中国是冬虫夏草最主要的分布地，占全球冬虫夏草分布面积的 90%以上[2]，由于全球气候变暖和青藏高原生态环境的变化，冬虫夏草的野生资源日趋减少，药源紧缺[3]。近年来，不少学者致力于人工培养冬虫夏草的研究[4-6]，但目前对于人工培养的冬虫夏草与野生冬虫夏草蛋白组差异的研究较少[7-9]。因此，本文对野生冬虫夏草完全体、菌虫复合体、子座及人工冬虫夏草完全体、菌虫复合体、子座的蛋白质组进行研究，旨在从蛋白质层面揭示野生冬虫夏草与人工培育冬虫夏草的差异，为后续科学评价人工冬虫夏草奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

贝克曼X-22R型低温高速离心机，Bio-Rad双向电泳系统，Bio-Rad凝胶扫描成像系统，上海岛韩实业公司DHG-9035A型电热恒温鼓风干燥箱。

1.2 试剂

聚丙烯酰胺预混液、甘氨酸、BSA（纯度≥99%）、Tris碱、CHAPS、碘乙酰胺、TEMED、SDS、尿素、过硫酸铵、覆盖琼脂糖、Quick Start™Bradford 1x Dye Reagent、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、IPG胶条（17 cm，pH3～10）、Bio-Lyte(pH3～10)、DTT、Precision Plus Protein™ 预染标准品、矿物油均购自Bio-Rad公司；PMS、APS、考马斯亮蓝R-250、低熔点琼脂糖、溴酚蓝、-巯基乙醇、Tween-80购自鹏程生物科技有限公司；水为超纯水，甲醇、冰乙酸为分析纯。

1.3 药材

野生冬虫夏草样品 2017 年采自四川省阿坝州小金县，经成都中医药大学国锦琳教授鉴定为正品野生冬虫夏草，人工冬虫夏草及小金蝠蛾幼虫样品由实验室制备提供，留样标本存放于成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。

2 方法

2.1 蛋白质提取

2.1.1 蛋白质的提取[10-11]取样品粉末约0.2 g，加入液氮适量，加入0. 02 mol·L-1PBS 缓冲液( pH7. 2)5 ml（1% PMSF），充分研磨至糊状，4 ℃ 浸提过夜。取出离心，4 ℃，13000 r·min-1，30 min，重复离心，收集上清液。

2.1.2 蛋白质的保存 将2.1.1得到的上清液用Bradford法[12]测定其含量，用0.22微米的膜除菌，无菌分装于0.5 mL EP中，进行标记，置4 ℃保存备用。

2.2 蛋白质含量测定

2.2.1 标准曲线制备配制 BSA标准溶液（1mg·mL-1），按下表制作蛋白质定量标准曲线，用紫外分光光度计检测OD595并记录。

2.2.2 样品含量测定 取2.1.1项下蛋白粗提液50 μL，采用2.2.1项进行蛋白质含量测定。

2.3 蛋白质纯化

2.3.1 TCA-丙酮沉淀蛋白[13]取2.1.1项下蛋白粗提取液，加入10倍体积TCA-丙酮（10%TCA，0.07%DTT），漩涡混合后于-20 ℃静置1 h，离心，10 min，13000 r·min-1，弃去上清液；加入-20 ℃预冷丙酮洗涤4次，室温自然干燥后水化上样缓冲液溶解，低温震摇1 h，离心取上清液，再次离心，取上清液保存备用。

2.4 双向电泳凝胶[13-15]

采用2.3.1项蛋白质样品，上样量为600 μg。第一向不搭盐桥的方式进行水化，设置水化温度20 ℃，被动水化12～16 h。第二向SDS-PAGE参照郭尧君[16]方法，凝胶浓度12%T，电泳过程起始采用低电流10 mA·gel-1，一小时后改变电流为30 mA·gel-1，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时停止电泳。

2.5 染色[17]

电泳结束后采用考马斯亮蓝法（0.1%考马斯亮蓝R250，45%甲醇，10%冰乙酸）染色，过夜，脱色液（10%甲醇，10%冰乙酸）摇床脱色至背景脱色干净。

2.6 凝胶扫描及图像分析

用Imagescaner II透射扫描仪对凝胶进行扫描，分辨率为150dpi，保存图像。使用PDQUESTTM Basic（Bio-Rad）和SPSS进行图像和数据的处理分析。

3 结果

3.1 标准曲线的绘制

以吸光度（Y）对蛋白含量（X）进行回归，得回归方程：Y=1.1676X+0.016 （R2=0.9992）。结果表明，蛋白含量在0～1µg·µL-1范围内有良好的线性关系。

3.2 蛋白质含量分析

表1 不同来源冬虫夏草蛋白质含量（n=3）

3.3 蛋白质斑点数量分析

表2 不同来源冬虫夏草蛋白斑点数（n=3）

3.4 差异蛋白斑点软件分析

3.4.1 人工冬虫夏草、野生冬虫夏草差异蛋白分析 在野生冬虫夏草与人工冬虫夏草Ⅰ的对比分析中，仅存在与野生冬虫夏草中的差异表达蛋白15个；仅存在与人工冬虫夏草Ⅰ中的差异表达蛋白2个。在野生冬虫夏草与人工冬虫夏草Ⅱ的对比分析中，仅存在与野生冬虫夏草中的差异表达蛋白25个；仅存在于人工冬虫夏草Ⅱ中的差异表达蛋白2个，表达量明显差异的蛋白3个。如图1-4。

图1 野生冬虫夏草与人工冬虫夏草Ⅰ差异表达蛋白

图2 人工冬虫夏草Ⅰ中存在的差异表达蛋白

图3 野生冬虫夏草与人工冬虫夏草Ⅱ差异表达蛋白

图4 人工冬虫夏草Ⅱ中存在的差异表达蛋白及含量明显减少的蛋白

3.4.2 人工冬虫夏草、野生冬虫夏草菌虫复合体差异蛋白分析 结果显示，在野生冬虫夏草菌虫复合体与人工冬虫夏草菌虫复合体部分的对比分析中，仅存在于野生冬虫夏草菌虫复合体中的差异表达的蛋白30个；仅存在于人工冬虫夏草Ⅱ菌虫复合体部分的差异蛋白4个。如图5-6。

图5 野生冬虫夏草菌虫复合体存在的差异表达蛋白

图6 人工冬虫夏草Ⅱ菌虫复合体部分存在的差异表达蛋白

3.4.3 人工冬虫夏草子座、野生冬虫夏草子座差异蛋白分析 结果显示，在野生冬虫夏草子座与人工冬虫夏草Ⅱ子座部分的对比分析中，仅存在于野生冬虫夏草子座中的差异表达蛋白4个；仅存在于人工冬虫夏草Ⅱ子座部分的差异表达蛋白22个。如图7-8。

图7 野生冬虫夏草子座存在的差异表达蛋白

图8 人工冬虫夏草Ⅱ子座部分存在的差异表达蛋白

4 讨论

本研究通过2-DE分析技术，获得了野生冬虫夏草、人工冬虫夏草及其菌虫复合体、子座的蛋白质表达图谱。图谱分析发现野生冬虫夏草与人工冬虫夏草蛋白质均具有良好的多样性，蛋白质种类丰富，在分子质量10～90 kDa范围内普遍分布，多样性良好。野生冬虫夏草与人工冬虫夏草蛋白质斑点分布模式相似。

采用Bradford法测定蛋白质含量，分析发现野生冬虫夏草蛋白质含量为0.65%，人工冬虫夏草蛋白质含量为0.57%，野生冬虫夏草子座蛋白质含量为0.89%，人工冬虫夏草子座蛋白质含量为0.54%，野生品蛋白质含量高于人工品，同时经蛋白质图谱对比分析发现，野生冬虫夏草及其菌虫复合体、子座虽然与人工冬虫夏草2-DE图谱相似，具有相似的蛋白质成分表达，野生冬虫夏草蛋白质斑点数为550，人工冬虫夏草蛋白质斑点数为364，野生冬虫夏草子座蛋白质斑点数为535，人工冬虫夏草子座蛋白质斑点数为300，在蛋白质斑点数量上野生品远高于人工品，提示在冬虫夏草菌侵染小金蝠蛾幼虫的过程中，环境因子对冬虫夏草内在蛋白质的表达具有正向的影响，基于蛋白质层面揭示了野生冬虫夏草在蛋白质的含量与数量上优于人工培育冬虫夏草。为后续从蛋白质水平上评价与鉴定人工冬虫夏草奠定了基础。