MiR-193b在肝癌组织中的表达及临床意义

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(南华大学第一附属医院检验科，湖南 衡阳 421001)

肝癌即肝细胞癌，是肝脏中最常见的肿瘤，发病率高，死亡率在各种恶性肿瘤中占第二位，对人类健康危害极大。microRNAs(miRNAs)是一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码RNA，通过与靶mRNA的3′-非翻译区结合，导致其翻译过程受到抑制或引起mRNA的降解，在转录后水平特异性影响靶基因表达[1]。近年研究发现，miRNAs失调与肝癌的发生、发展密切相关[2-3]。MiR-193b的编码基因位于人第16号染色体p13.12上，在非小细胞肺癌、食管鳞癌组织中呈低表达[4-5]。本课题组前期研究表明，miR-193b通过caspase-3途径降低HepG2细胞对顺铂的耐药性[6]，提示这种miRNA具有抗肝癌作用。然而，miR-193b在肝癌组织中的表达及与患者预后的关系仍不清楚。本研究采用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测miR-193b在肝癌组织及相应的癌旁非肿瘤组织中的表达，从而探讨其在肝癌发生、发展中的作用及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料40例原发性肝癌组织及相应的癌旁非肿瘤组织标本均为本院2008年1月～2011年12月手术切除后的经石蜡块保存的组织标本，并经病理检测确定，所有病例术前未行化疗和放疗，亦未合并其它系统恶性肿瘤。根据档案室患者病历资料，按年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、TNM分期情况及淋巴结转移进行分类，并记录5年内的生存情况。本实验经南华大学第一附属医院伦理委员会批准，同时征得患者或者其家属的知情同意。

1.2主要试剂Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、SYBR Green Real Time PCR Master Mix分别由美国Promega公司、上海生工生物工程公司、日本 Toyobo公司提供。

1.3荧光实时定量PCR(qRT-PCR) 采用Trizol试剂提取组织标本中的总RNA，并按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.22设计本实验所使用的引物，并由华大基因生物科技有限公司合成，序列如下：miR-193b正义：5′-GTGCAGGGTC CGAGGT-3′，反义：5′-CTGTGCGTGTGACAG CGGCTGA-3′；以U6为内参， U6引物为：正义：5′-CTCG CTTCGGCAGCACA-3′，反义：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。在Roach480 qRT-PCR仪上进行PCR反应，反应条件：95℃预变性15 min，94℃变性15 s，55℃复性30 s，70℃延伸30 s，总共40个循环。利用ΔΔCt值法定量目的基因miR-193b表达水平。实验过程中同时设置阴性、阳性对照。

1.4统计学分析通过SPSS14.0软件包进行统计学分析，两组均数比较行t检验，率的比较采用χ2检验，生存率分析利用Kaplan-Meier法，以P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-193b在肝癌组织中的表达利用qRT-PCR检测miR-193b在肝癌组织及相应的癌旁组织中的表达，其qRT-PCR的溶解曲线见图1，从曲线上分析，各个标本的熔点基本上都集中在89℃左右，可以认为qRT-PCR的特异性较好，结果分析发现肝癌组织miR-193b表达水平明显低于癌旁组织，差异有显著性(t=5.32,P<0.01)(图2)。

图1 miR-193b的qRT-PCR的溶解曲线

图2 两组miR-193b表达水平比较 与癌旁组织相比，*P<0.05

2.2 miR-193b表达与肝癌临床病理特征分析为了进一步探讨miR-193b与肝癌临床病理特征之间的关系，以中位数为界值(1.68)将其分为miR-193b低表达组(≤中位数)和miR-193b高表达组(>中位数)，分别包括16、24个样本。如表1所示，miR-193b表达与分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05)，而与年龄、性别、肿瘤大小无相关性(P>0.05)。

表1 miR-193b表达与肝癌临床病理特征的关系

续表

临床参数nmiR-193b表达高(n=16)低(n=24)χ2PTNM分期 I+II18101526.53<0.05 III+IV2266淋巴结转移 无1371621.46<0.05 有2795

2.3 miR-193b表达与肝癌患者生存的关系对40例肝癌患者术后生存状况进行分析，相对于miR-193b低表达组，miR-193b高表达组患者5年生存率明显增加，差异有统计学意义(χ2=25.38,P<0.05)，见图3。

图3 肝癌患者Kaplan-Meier生存曲线

3 讨论

肝癌是最常见的消化系统肿瘤之一，恶性程度高，预后差，其发生是一个多因素、多步骤的复杂过程，与乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染及黄曲霉素、酒精、亚硝胺类物质的长期摄入相关，但其发病机制仍未完全阐明。肝癌发病隐匿，许多患者确诊时已到中、晚期，由于已发生局部肿瘤广泛浸润和/或远处转移而丧失了最佳的治疗时机。近年来，尽管已采取包括手术、放化疗在内的积极治疗措施，5年生存率仍达不到预期水平，同时具有较高的复发倾向[7]。因此，深入研究肝癌的发病机制并从中找出有效的分子标记物对于早期诊断、改善患者预后具有十分重要的意义。

随着人类基因组计划的完成，后基因组时代的来临，包括miRNAs在内的非编码RNA已成为生命科学最热门的研究领域之一。作为一种多效性因子，miR-193b在细胞的增殖、分化、凋亡、自噬及血管生成等生物学过程中发挥重要作用。研究表明，miR-193b在肿瘤形成和发展中具有多重功能，扮演着抑癌基因的角色。例如，Hulin，等[8]用miR-193b mimic处理乳腺癌细胞，发现外源性给予miR-193b拮抗细胞迁移及新生血管形成。下调miR-193b表达则增加尿激酶型纤溶酶原激活物水平，进而促进乳腺癌细胞侵袭与转移[9]。Zhang，等[10]报道，miR-193b在卵巢癌组织中表达下调，当其过表达时可显著抑制卵巢癌细胞A2780增殖，并增加紫杉醇化疗敏感性。在敲除头颈鳞状细胞癌FaDu细胞系的 miR-193b基因后，细胞的增殖、迁移、侵袭能力明显提高[11]。我们的前期研究也发现，miR-193b通过靶向沉默髓细胞白血病基因-1抑制肝癌细胞增殖，并诱导其凋亡[12]。本研究结果显示，肝癌组织中miR-193b 表达水平较癌旁非肿瘤组织降低；miR-193b表达与肿瘤分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关，但与年龄、性别、肿瘤大小无相关性；miR-193b高表达组患者5年生存率明显高于miR-193b低表达组，这些结果表明miR-193b可能在肝癌的发生、发展中扮演重要作用，可作为评估肿瘤恶性程度及判断预后的分子标记物，但具体作用机制仍有待进一步研究。随着研究的深入，miR-193b可望成为肝癌防治的一个潜在的、有价值的靶点。