术后标本行分子生物学检测对结核病患者诊疗的价值

温子禄 王琳 王军 陈辉 李洪伟 朱益军 蒋韶宁 张舒林 宋言峥

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的长期危害人类健康的一种慢性疾病，是全球十大死因之一。WHO[1]估计，2016年有60万例利福平耐药新发患者，其中有49万例为耐多药结核病。近年来，非结核分枝杆菌(NTM)肺病呈快速增多趋势，NTM肺病与结核病相比无临床特异性，误诊率极高。大多数NTM对抗结核药物天然耐受，严重干扰了结核病的预防与治疗。由于耐药MTB的流行，严重影响了结核病的化疗效果。笔者对在我院胸外科接受手术治疗、临床资料齐全的结核病患者进行回顾性分析，初步探讨术后标本行分子生物学检测对结核病患者诊疗的价值。

资料和方法

一、 研究对象

回顾性分析2015年1月至2018年2月期间在上海市公共卫生临床中心胸外科接受手术治疗、并且临床资料齐全的170例结核病患者。170例患者中，男100例(58.82%)、女70例(41.18%)； 1～18岁年龄组18例(10.59%)、19～65岁年龄组142例(83.53%)、66～82岁年龄组10例(5.88%)；肺结核39例(22.94%)、肺外结核131例(77.06%)。

二、研究方法

取术后标本进行分子生物学检测，主要包括菌种鉴定和耐药基因检测两方面，本研究采用的分子检测方法为PCR膜条杂交、二代测序技术。所有患者均进行痰及穿刺活检或者手术标本进行抗酸染色涂片检测。在进行上述涂片抗酸染色检查的同时，170例患者的标本均由检验科进行分枝杆菌改良罗氏固体培养、BACTEC MGIT 960快速液体培养(简称“MGIT 960培养”)及药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，然后采用免疫胶体金法检测MGIT 960培养产物中的MPB64抗原(以下简称“MPB64抗原检测”)，以检测结核分枝杆菌。

结 果

一、抗酸染色涂片检测

痰涂片抗酸染色检测的阳性率为9.41%(16/170)，其中肺结核患者痰涂片抗酸染色检测的阳性率为23.08%(9/39)； 而非痰液(包括穿刺活检、手术标本如脓液或分泌物等)涂片抗酸染色检测的阳性率为51.76%(88/170)(表1)。

二、 分枝杆菌培养及药敏试验

分枝杆菌培养阳性率为27.65%(47/170)，药敏试验耐药结核病的检出率为14.12%(24/170)(表1)。

表1 各检测技术对本组170例患者结核分枝杆菌或药敏试验检出阳性率的统计

表2 7例NTM感染患者临床诊断及标本行分子生物学技术与涂片抗酸染色检测结果的比较

注“-”表示未做相应的检测；“N”代表阴性结果，指培养结果为阴性，无法判断是否耐药

三、 分子生物学菌种鉴定

47例分枝杆菌培养阳性的检测中42例MPB64抗原检测为阳性，5例MPB64抗原检测为阴性；根据试剂盒的说明，培养阳性MPB64阳性可以判定为结核分枝杆菌，而培养阳性MPB64阴性可以判定为NTM。术后对手术标本进行分子生物学菌种鉴定的阳性率为51.76%(88/170)。阳性结果中7例为NTM，4例培养联合MPB64抗原检测结果显示为NTM，但未进行菌种鉴定；3例培养结果为阴性无法进行MPB64抗原检测。7例标本分子生物学菌种鉴定结果为：1例瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌复合感染，3例胞内分枝杆菌， 1例海分枝杆菌， 1例鸟分枝杆菌，1例脓肿分枝杆菌(表1，2)。

四、 分子生物学耐药检测

除去7例NTM感染患者，剩余的163例患者进行了分子生物学耐药检测；其中，一线抗结核药物耐药(基因)检出率为54.60%(89/163), 二线抗结核药物耐药(基因)检出率为49.69%(81/163)。与培养后药敏试验结果相比，培养后药敏试验阳性标本中有29.79%(14/47)在分子生物学耐药基因检测的结果为阴性，而分子生物学耐药检测与表型药敏检测结果一致性为90.00%(27/30)；分子生物学耐药基因检测与MGIT 960培养药敏试验联合判断对耐药结核病的检出率为63.19%(103/163)。

讨 论

WHO[1]2017年全球结核病相关报告估计，有60万例新发结核病患者对利福平耐药， 其中49万例患者为耐多药结核病(MDR-TB)。MDR-TB的负担主要落在3个国家：印度、中国和俄罗斯，共占全球MDR-TB患者的近1/2。 2016年，约有6.2%的MDR-TB患者为广泛耐药结核病(XDR-TB)。在全球范围内，目前只有54%的MDR-TB患者和30%的XDR-TB患者得到了成功治疗。2016年5月12日， WHO的新建议旨在通过使用新型快速诊断试验和更短、更便宜的治疗方案，加快检测并改善MDR-TB患者的治疗效果[1]。

外科技术用于结核病的治疗已有100余年的历史。通过手术不仅切除了结核病灶、降低了其对周围人群的传染性，同时可以对切除组织标本中的结核分枝杆菌进行培养和药敏试验，进一步找到更有效的药物，巩固手术疗效，减少手术并发症。这对于结核病的控制和个体化治疗都是非常重要的[2-3]。早在2006年，WHO《耐药结核病管理指南》中，已经推荐将外科治疗作为一种治疗MDR-TB患者的重要手段；WHO[4-5]之后的耐药结核病管理2008版指南及2016版指南都将外科作为一种积极治疗手段，而不是作为辅助治疗手段来治疗有手术指征的MDR-TB患者。

MTB是引起结核病的单一病原菌，可侵犯全身。在我国，抗酸涂片镜检作为诊断结核病的初步依据，但其敏感度和特异度较差，无法区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。随着实验条件的改进，目前已研究出了多种实验室检测技术，主要有四类：(1)生化法。主要依据是菌株的产色特征和生长速度等菌落生长特性，以及菌株不同的生化特征[6]。(2)基因分析法。分子生物学方法使TB的诊断周期由数周缩减到几天，已成为TB快速诊断的辅助手段[7]。(3)免疫学法。1976年，Nassau等首先将酶联免疫吸附试验(ELISA) 用于血清结核抗体的检测。当前应用于临床的结核病免疫学诊断包括体液免疫学诊断(血清学诊断)和细胞免疫学诊断。目前，血清抗体检测已成为诊断结核病常用的辅助手段之一[8-9]。Liu等[10]于2017年报告了一项将抗体标记、能量聚集纳米盘与高通量质谱技术相结合的方法(NanoDisk-MS，纳米盘-飞行质谱技术)，用以检测经消化的血清样本中结核特异性早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)；该技术敏感度、特异度高，能够快速、定量检测外周血标本，以诊断活动性结核分枝杆菌感染并监测抗结核药物治疗的效果。(4)菌体特定成分特性分析法：美国MIDI公司开发的Sherlock微生物鉴定系统(microbial identification system，MIS) 可分析脂肪酸，通过单次实验便能较准确地鉴定到种[11]。

NTM引起的疾病症状与MTB引起的疾病症状类似，但是对经典的抗结核药物治疗无效，容易导致误诊和不适当的治疗，现已经广泛引起临床医生的重视[12]。MTB与NTM的早期验证和NTM菌种的鉴定对于痰涂片阳性患者的正确治疗至关重要。全球2008年从肺部样本中分离的不同NTM的菌种有：鸟分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌、蟾分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、 偶发分枝杆菌[13]。中国不同地区的NTM感染情况不同，一项横断面研究入选了2012年1月至2014年12月期间，在两个独立的结核病研究中心(广州市胸科医院和上海市肺科医院)分别收集了938和512例NTM样本，包括门诊和病房[14]。

NTM感染呈上升趋势，2000—2012年间，在我国台湾大学医学院分枝杆菌研究室数据库登记，并通过培养确定MTB或NTM阳性者，其中包括报告了肺结核、NTM肺部感染和NTM定植的年发病率[15]。北美NTM感染与年龄有关且呈上升趋势，一篇综述检索了2009—2014年间发表的关于北美人群感染NTM的论文，总结认为： NTM患病与年龄有关，老年患者更易感染NTM；NTM患病率呈上升趋势，且与环境因素有关，特别是与水、土壤的暴露有关；NTM病死亡率高，1999—2010年间美国NTM病的死亡率为0.1/10万；55岁以上老年患者，特别是女性患者具有更高的死亡率[16]。

NTM病主要损害肺部，具有与结核病临床表现相似的全身中毒症状和局部损害表现，在无菌种鉴定结果的情况下，可能误诊为结核病；多数NTM对抗结核药物耐药，用抗结核药物治疗效果不佳，并且药物会对患者的肝脏及中枢神经系统造成损伤。由于NTM病与结核病治疗上的差异，确定NTM病在临床上有着重要意义[12]。

细菌耐药包括多种机制，大致可分为五类：(1)减少药物的吸收；(2)增加外排泵的表达；(3)酶的失活；(4)抗生素靶标的修饰；(5)降低催化前导药物活化酶的活性。MTB具有特异性、高度疏水性的细胞壁，组成了天然的渗透屏障，阻碍很多药物的通透，与药物相关的基因突变是MTB对多数抗结核药物获得性耐药的主要耐药机制[17-18]。

随着耐药MTB的逐渐增多，MTB耐药性检测成为防控结核病的关键问题。目前，临床实验室药敏试验仍以绝对浓度法和比例法等常规方法为主，具有生长依赖性，即以细菌生长为终点判断结果。由于MTB生长缓慢，需1～2个月方能获得培养和药敏试验结果，远不能满足临床及时治疗的需要。所以，研发快速敏感的新型药敏试验方法则显得尤为重要。应用分子生物学技术进行MTB耐药性检测已成为现代耐药性检测的必然趋势，如线性探针反向杂交法(line probe assay，LiPA)、基因芯片检测技术和二代测序技术等；WHO最新推荐使用的Xpert MTB/RIF检测技术，从标本处理到结果检测仅需几个小时，敏感度为96.7%，特异度达98.6%，是未来耐药性检测的发展方向[19-21]。

结核病尤其是菌阴肺结核的早期诊断，是对临床结核病防治工作一个严峻的挑战。控制结核病传播的关键是尽早发现、隔离、治疗活动性结核病患者。分子生物学检测技术在结核病术后快速诊断中具有重要的价值，可区分结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌及是否耐药，为结核病术后正确用药提供重要的参考。