白芷药材及其混伪品的ITS2序列分子鉴定△

吴正军，魏伟锋，韩正洲，崔英贤，陈新连，王瑀*

(1.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518110；2.国家中成药工程技术研究中心，辽宁 本溪 117004；3.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所/国家中医药管理局 中药资源保护重点研究室，北京 100193)

白芷始载于《神农本草经》，并被列为中品，在我国拥有悠久的药食两用历史[1]。《中华人民共和药典》(2015年版)规定，白芷药材为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根[2]，其性温、味辛，入胃、大肠、肺经，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓的功效，用于感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻渊、牙痛、带下、疮疡肿痛等症[2]。现代药理学研究表明，白芷具有解热、镇痛、平喘、降压以及兴奋呼吸和运动中枢等作用，同时白芷在抗菌、解痉、美白等方面也具有很好的作用[3-7]。因其能“长肌肤，润泽，可作面脂”，成为我国古代美容护肤类方剂的宠儿[8-9]。另外，白芷制剂结合黑光照射在治疗白癜风和银屑病等方面也取得了很好的效果[10-11]。近年来，临床用药量的增加以及美容产业的发展，造成了白芷药材在市场流通中需求量大幅增加的现象。白芷以根入药，经加工炮制后外形特征丢失，与其他近缘种根类药材极其相似，鉴定困难，市场流通中白芷药材的混伪、掺假现象十分严重。白芷药材常见混伪品有糙独活HeracleumscabridumFranch.、白亮独活H.candicansWall.ex DC.、白云花H.repulaFranch.、下延叶古当归A.decurrensLedeb.、隔山香Ostericumcitriodorum(Hance)Yuan et Shan、短毛独活H.moellendorffiiHance等，多种混伪品出现在白芷药材流通的各个环节，严重影响了白芷药材临床用药的准确性和安全性，因此急需寻找一种快速、准确的分子鉴定方法，以确保临床用药安全。

DNA条形码鉴定技术在中药材鉴定中具有高效、快速、准确率高等特点，是近年来动植物药材鉴定的主要方法之一。ITS2序列被选为药用植物鉴定的标准DNA条形码[12]，并已经在多个药用植物及其混伪品的鉴定中得到验证[13-17]。本研究利用ITS2序列对白芷、杭白芷及其混伪品进行鉴定，旨在建立一种快速、准确鉴定白芷药材的方法，以规范白芷药材市场，保证临床用药安全。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究共涉及白芷、杭白芷及其混伪品共计7个物种44份样本，白芷样品分别来自重庆、云南、安徽、河南等地，杭白芷样品分别来自广西、四川、重庆等地。实验样品均经中国医学科学院药用植物研究所林余霖研究员鉴定。另外，从GenBank上下载部分白芷及其混伪品的ITS2序列。实验样品来源详见表1。

表1 白芷、杭白芷及其混伪品样品信息表

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR扩增及测序 样品处理参照陈士林等[18]的研究方法，白芷药材样品用75%乙醇擦拭表面后，刮去外表皮，取样约40 mg，硅胶干燥后的叶片样品取约20 mg，并加入约样品量10%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次·s-1)后，用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA。提取过程完全按照试剂盒说明书进行，其中根类样品在加入细胞裂解液后56 ℃水浴过夜，叶片类样本在65 ℃水浴放置30 min。PCR扩增体系的配制及扩增程序的设定依照文献[19]。将PCR产物采用ABI 3730XL 测序仪进行双向测序。

1.2.2 数据处理 测序峰图利用CodonCode Aligner V 3.7.1(CodonCode Co.，USA)校对拼接，去除低质量区和引物区。获得的所有序列采用基于隐马尔可夫模型的HMMer注释方法去除两端5.8 S和28 S区段即可获得ITS2间隔区序列[20]。然后，将所有序列用软件MEGA 6.0(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)分析比对，并基于K2P模型进行种内种间变异位点和遗传距离的分析，用邻接(NJ)法构建系统聚类树，利用bootstrap(1000次重复)检验各分支的支持率。

2 结果

2.1 白芷药材ITS2序列特征及种内变异

白芷不同来源的ITS2序列共15条，序列长度为227 bp，GC含量为54.26%～55.51%，平均GC含量为55.05%。种内共存在2个变异位点，分别是第171位的T-C变异和第208位的G-A变异，共获得3种单倍型(见表2)，种内K2P遗传距离为0～0.009 2；杭白芷不同来源的ITS2序列共10条，长度均为227 bp，GC含量为55.07%，种内无变异位点，种内K2P遗传距离为0，说明杭白芷种内ITS2序列高度保守。杭白芷ITS2序列与白芷主导单倍型(H1)序列相同，序列类型见图1。白芷主导单倍型(H1)样本ITS2序列峰图特征见图2。

表2 白芷单倍型类型

图1 白芷(H1)ITS2序列

图2 白芷ITS2序列测序峰图

2.2 白芷药材及其混伪品ITS2序列种间变异分析

白芷、杭白芷及其混伪品的ITS2序列共44条，利用MEGA 6.0计算ITS2序列的种间K2P遗传距离，结果显示，白芷与杭白芷的种间K2P遗传距离是0～0.004 5，白芷与其混伪品的种间K2P遗传距离为0.052 8～0.321 3，远大于白芷种内、白芷与杭白芷的种间K2P遗传距离，所以用ITS2序列能很好地鉴别白芷药材及其混伪品，具体K2P遗传距离如表3所示。白芷、杭白芷及其混伪品种间变异位点见图3。

2.3 白芷药材及其混伪品的NJ树鉴定

基于白芷、杭白芷及其各混伪品的ITS2序列主导单倍型构建NJ系统聚类树，结果表明白芷和杭白芷聚为一支，支持率为99%，说明两基原植物亲缘关系较近，仅靠ITS2序列无法进行区分。同时，白芷、杭白芷与各混伪品均能明显分开，支持率均大于50%(见图4)。因此，ITS2序列作为DNA条形码可以很好地将白芷药材(白芷、杭白芷)及其混伪品区分开。

表3 白芷、杭白芷及其各混伪品的种间K2P遗传距离

注：.表示与第一行相同碱基。图3 白芷、杭白芷及其混伪品种间变异位点

图4 基于ITS2序列构建白芷药材及其混伪品的NJ树

3 讨论

中药白芷为根类药材，细胞中存在多糖和多酚等次生代谢产物，这些物质在DNA提取过程中易与DNA发生共沉淀，影响DNA的提取效率。因此，实验中增加取样量，同时根类药材先用75%乙醇将根的表面擦拭干净，取靠近表皮的内部材料，以避免真菌类污染。另外，样品中加入的PVP-40不仅可以与多酚形成一种不溶的络合物，还可以和多糖结合，有效去除样品中残留的多酚和多糖类杂质，减少DNA污染[21]。同时，实验过程中适当延长根类药材的水浴时间，使细胞充分裂解释放DNA，提高提取效率。

DNA条形码技术至今已有十多年的发展历程，它打破了传统的形态学物种鉴定的局限性[22]，为中药鉴定学、亲缘学及进化学等领域的研究带来了新的发展机遇。陈士林等[23]认为基于ITS2序列的药用植物分子鉴定技术作为中药鉴定领域的新方法，不仅要保证其具有结果准确、可重复性强等特点，还要保证其在中药鉴定领域具有较强的实用性和通用性。辛天怡等[24]通过研究证实了ITS2序列在羌活药材DNA条形码鉴定中具有很好的准确性及稳定性。陈新连等[25]研究表明ITS2序列可以鉴别朱砂根及其混伪品。本研究成功获得白芷ITS2序列共15条，共有2个种内变异位点，种内平均K2P遗传距离为0.002 7，白芷与其变种杭白芷的种间K2P遗传距离为0～0.004 5，表明白芷种内ITS2序列变异较小，其作为DNA条形码鉴定的通用序列具有很好的稳定性，且白芷药材两基原植物亲缘关系较近。通过对白芷药材及其混伪品进行基于ITS2序列的鉴定分析可知，白芷与其混伪品的种间K2P遗传距离为0.052 8～0.321 3，杭白芷与其混伪品的种间K2P遗传距离为0.060 8～0.339 5，均远大于白芷和杭白芷种内、种间的K2P遗传距离；且在NJ系统进化树中，白芷与杭白芷聚为一支，无法区分开，这两个物种的鉴别有待于更进一步的研究。其混伪品单独聚为一支，与白芷药材(白芷、杭白芷)明显区分开。NJ树结果表明，ITS2序列能够实现对白芷药材及其混伪品的准确鉴定，有利于白芷药材在市场上的流通和管理，确保临床用药安全。