质谱流式细胞技术诊断结肠癌患者抗原CD45的临床价值

孙倩　　杨丽君　　万晓晨

[摘要] 目的 探讨应用离心力对质谱流式细胞技术对结肠癌患者抗原CD45的诊断价值及对其预后质量的影响。 方法 选取2011年1月～2012年1月我院收治的结肠癌患者120例，收集结肠癌患者的结肠细胞，将收集的结肠癌细胞进行离心，分为 400 g离心组为研究组和 140 g 离心组为对照组（每组细胞数量相同，且均为1×105个）。采用质谱流式细胞技术对两组死亡细胞百分比、抗原CD45表达情况及活细胞中高表达CD45的细胞数量进行检测。 结果 经过研究分析，研究组抗原CD45表达阳性率、抗原阳性率低于对照组，死亡细胞百分比显著高于对照组（P<0.05）；离心前两组患者K562杀伤比率、NK细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞对比差异无统计学意义（P>0.05），离心后研究组K562杀伤比率、NK细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞显著低于對照组（P<0.05）。 结论 对结肠癌患者在运用质谱流式细胞技术对其抗原CD45的诊断同时应用离心力技术，一方面能够提高诊断价值，另一方面能够改善患者的预后质量，值得在临床上进行推广与使用。

[关键词] 结肠癌；离心力；质谱流式细胞技术；抗原CD45；诊断价值；预后质量

[中图分类号] R735.35 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）17-0125-03

The clinical value of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression in patients with colon cancer

SUN Qian YANG Lijun WAN Xiaochen

Department of Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

[Abstract] Objective To explorethe effect of centrifugal forces on clinical valueand patients life quality of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression incolon cancer cells. Methods 120patients with colon cancer who were treated in our hospital from January 2011 to January 2012 were selected. Their colon cells were collected and randomly divided into two groups by centrifugal forces as follows： 400 g centrifugal forces group as study group and 140 gcentrifugal forces group as control group （1×105 cells in each group）. We detected the percentage of dead cells， the expression of CD45 and the number of live cells with high expression of CD45 by mass cytometry. Results After analysis， the positive rate of antigen CD45 expression， the positive rate of antigen of the study group were lower than those of the control group， the percentage of dead cells of the study group were significantly higher than those of the control group（P<0.05）. There was no significant difference in K562 killing ratio， NK cell， B lymphocyte and T lymphocyte in two groups before centrifugal（P>0.05）. After centrifugation， K562 killing ratio， NK cell， B lymphocyte and T lymphocyte of the study group were significantly lower than those of control group（P<0.05）. Conclusion The use of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression in patients with colon cancer can improve the value of pertinence as well as the quality of prognosis of patients， deserving clinical application and popularization.

[Key words] Colon cancer； Centrifugal forces； Mass cytometry； Antigen CD45； Diagnostic value； Quality of prognosis

医学中所指的恶性肿瘤常被人们称之为癌症，临床实践中，结肠癌的发病率和致死率较高，是最为常见的也是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。结肠癌可以进一步分为小细胞型和非小细胞型，最近几年，我国结肠癌患者数量极速增加，据权威机构统计，年平均增长速度高达27.6%[1]。结肠癌有着比较明显的特点，如患病人群一般在42周岁以上；男性患者远远高于女性患者，比例大约为4.5：1；发病初期症状不易被觉察，大部分患者被确诊时已接近晚期；不宜采取外科手术方法治疗，多采用介入手段，如放化疗等[2]。临床实践中，化疗方法能够有效延缓患者生存时间，提升患者生存质量，是较有效的治疗手段。近几年，随着分子生物学的发展，流式细胞技术已经广泛应用于癌症的研究与治疗领域。流式细胞包括质谱流式细胞技术，其原理是采用同位素标记法进行标记抗体，使得细胞能够多参数进行检测，有关研究发现，最多可以检测数目可达50种左右[3]。虽然这几年这种技术的使用越来越多，但是在实体肿瘤方面的应用尚未成熟，仍是研究阶段。而本文研究的CD45是一种酶受体，具体酶包括酪氨酸磷酸酶，这些酶是诊断结肠癌必备的指标之一[4]。针对这种问题，我院选取2011年1月～2012年1月收治的结肠癌患者120例，收集结肠癌患者的结肠细胞，将收集的结肠癌细胞进行离心，分为 400 g离心组和140 g离心组，采用质谱流式细胞技术对两组死亡细胞百分比、抗原CD45表达情况及活细胞中高表达CD45的细胞数量进行检测，分析结肠癌患者应用离心力对质谱流式细胞技术对其抗原CD45的诊断价值及对其预后质量的影响。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月～2012年1月我院收治的非小细胞肺癌120例，进行实验离心后，分为 400 g离心组为研究组和140 g离心组为对照组。上述患者均已通过病理切片和影像检查手段予以确诊。纳入标准[5]：经过西医和传统的中医诊断予以确诊；年龄≥25岁；对化疗无相关禁忌；KPS评分>70分；预计生存期>3个月；多发性病灶至少一个可测量；无法采取手术治疗；病情属于中晚期[3]。排除标准[6]：下列类型的患者不能参与本次研究：（1）心脏等脏器严重受损或者患有出血性相关病症的患者；（2）正处于哺乳或妊娠期的女性患者；（3）已经过手术和放疗手段治疗且结束时间未超过三个月的患者；（4）治疗过程中出现感染，尚未得到控制的患者；（5）药物性过敏体质的患者。

对照组男47例，女13例，年龄29～73岁，平均（47.5±1.2）岁；研究组男51例，女9例，年龄31～76岁，平均（49.6±2.4）岁。两组患者的一般资料有可比性（P>0.05），均知情同意本研究，并经过医院伦理委员会批准。

1.2 方法

仪器：细胞培养箱、搅拌器、质谱流式细胞仪等。首先是细胞培养及分组处理。选取2011年1月～2012年1月我院收治的结肠癌患者120例，收集结肠癌患者的结肠细胞，将结肠癌细胞在培养基中进行培养。培养的条件为：培养箱要经过严格消毒且对培养箱要进行恒温恒压设定，进出细胞间的实验人员要进行消毒且培养箱中要放置4%多聚甲醛固定液，具体配置如下：PBS：0.1M的PBS、Nacl 1.7 g、Na2HPO4·12H2O 6.16 g、NaH2PO4·2H2O 0.56 g、双蒸水定容至200 mL、多聚甲醛8 g、用10 mL 0.1N NaOH调解至pH 7.4左右（建议用1N的NaOH调pH），磁力搅拌器上加热（不超过60℃）攪拌，溶解需大约4～5 h，0.1N NaOH配制：NaOH 0.02 g、双蒸水定容至5 mL，1N NaOH配制：NaOH 0.2 g、双蒸水定容至5 mL。之后选择生长期处于对数生长期的结肠癌细胞，采取消化酶（胰酶），进行消化后分为两组：400 g离心力组与140 g离心力组进行离心。对于400 g离心力组：首先对消化后的细胞进行PBS洗涤，之后细胞采用 400 g离心力，进行离心5 min，重复离心3次后，舍去上清，取沉淀。对于140 g离心力组：首先对消化后的细胞进行PBS洗涤，之后细胞采用140 g离心力，进行离心5 min，重复离心3次后，舍去上清，取沉淀。两组沉淀细胞在流式细胞仪中进行检查。将两组细胞分别放入试管中，分别加入甲醇进行固定，固定半小时后进行染色，往试管中加入染色缓冲液，先混匀再静止放置半小时待充分染色均匀后进行离心。离心后取沉淀，往沉淀中加入PBS缓冲液后，启动质谱流式细胞仪，对细胞表达情况进行分析。

1.3 疗效判断标准

1.3.1 不同离心力组死亡细胞对比 对研究组与对照组细胞进行离心后，采用质谱流式细胞仪，对活细胞以及死亡细胞进行分析，并统计死亡细胞百分比。使用仪器软件GraphPad Prism统计软件。

1.3.2 不同离心力组抗原CD45表达情况 检查仪器主要是质谱流式细胞仪，检查两组细胞的抗原CD45表达情况进行对比。若患者抗原CD45表达则为阳性，阳性率为抗原CD45表达的细胞比总细胞比值。

1.3.3 不同离心力组患者免疫学指标对比 化学免疫分析法（CMIA）采用美国雅培ARCHI-TECTi2000及其配套试剂产品，根据产品说明书进行操作，步骤主要包括加样、孵育、洗板、加酶、比色等。设计好标本位置、检测项目，按开始键即可。患者进行抽血检验，酶联免疫吸附试验判断细胞内K562含量以及NK细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞的数量，以确定患者各类细胞如B/T淋巴细胞的被杀伤比率[7]。

1.4统计学方法

数据应用SPSS18.0进行分析，其中计数资料以（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，采用t检测，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组抗原CD45表达情况比较

经分析，研究组抗原CD45表达阳性率、抗原阳性率皆低于对照组，而死亡细胞百分比情况显著高于对照组（P<0.05）

2.2 两组离心前后免疫学指标比较

离心前两组患者K562杀伤比率、NK细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞对比无明显区别（P>0.05），离心后研究组K562杀伤比率、NK细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞显著低于对照组（P<0.05）

3讨论

随着我国经济的发展，科技水平也在不断发展。一些科学技术也在不断应用于医疗技术之中。近年来，随着分子生物学迅猛发展，对于人体细胞水平的研究在不断进行之中[8]。而质谱流式细胞仪技术的诞生大大帮助了人们对细胞的研究。质谱流式细胞技术是将质谱检测技术与传统流式细胞技术相结合，对细胞进行跟踪分析。临床实践中，化疗方法能够有效延缓患者生存时间，提升患者生存质量，是较有效的治疗手段[9]。近几年，随着分子生物学的发展，流式细胞技术已经广泛应用于癌症的研究与治疗领域。流式细胞包括质谱流式细胞技术，其原理是采用同位素标记法进行标记抗体，使得细胞能够多参数进行检测，有关研究发现，最多可以检测数目可达50种左右。虽然这几年这种技术的使用越来越多，但是在实体肿瘤方面的应用尚未成熟，仍是研究阶段[10]。

本文研究中，在进行质谱流式细胞检测前，对细胞进行进一步的加工也就是细胞的离心纯化[11]。通过选择不同的离心力，将细胞进行分类，在本文选择的离心力分为两组一种为140 g、一种是400 g。且进行离心时注意离心力的选择，要适当，不能选择过大或者过小。因为过大时，部分细胞会破裂、震碎[12]。离心力过小时，一些杂质分离不出，使得检测结果有误差。我院所采取的对照试验表明，400 g离心力组抗原CD45表达情况显著高于140 g离心组（P<0.05）。

本文研究的CD45是一种抗原，在临床上它的别称为白细胞共同抗原，这种抗原在白细胞中均进行表达，并且临床研究显示，CD45的表达含量与淋巴细胞的活化程度密切相关[13]，且随着结肠癌病发程度越大，其表达量越低。而在临床实践中，一般对恶性肿瘤特别是晚期恶性肿瘤治疗采用传统化疗方案副作用大、效果差，因此，临床上从细胞角度进行分析，找出更加简单的治疗方法，缓解患者痛苦，延缓患者生命[14]。临床用于治疗癌症，原理一般为：（1）能够有效控制肿瘤的产生和增长，将肿瘤发展控制在初期，进而致使癌细胞死亡[15]；（2）能够有效控制癌细胞转移，对于恶性肿瘤发展具有明显的阻碍作用，迟滞肿瘤生成，以此实现阻碍肿瘤生成和扩散的的目的[16]；（3）提高人体免疫功能，可以提高细胞活力，破坏恶性肿瘤细胞的生成，全面提升患者免疫能力[17]；（4）减轻化疗副作用，使蛋白含量和基因功能方面加强人体有效因子的产生，增强细胞功能，提升患者白细胞数量；（5）明显改善患者消化道功能，增强胃壁厚度，以此降低患者不良反应[18-20]。本文研究发现，离心前患者免疫学指标对比无明显区别（P>0.05），离心后研究组免疫学指标显著优于对照组（P<0.05）。

综上所述，对结肠癌患者在运用质谱流式细胞技术对其抗原CD45的诊断同时应用离心力技术，一方面能够提高诊断价值，另一方面能够改善患者的预后质量，值得在临床上进行推广与使用。

[参考文献]

[1] 姜霞，翟从劼，张峰，等. 离心力对质谱流式细胞技术检测结肠癌细胞表面抗原CD45表达结果的影响[J]. 山东医药，2017，57（24）：13-15.

[2] 冯文磊，张猛，印双红，等. 改良差时贴壁法分离培养鉴定小鼠骨髓间充质干细胞和内皮前体细胞[J]. 解剖学报，2015，46（2）：282-288.

[3] 李艳荣，郭莲怡. 溃疡性结肠炎患者外周血T细胞表面CD4+CD45+分子表达的变化及临床意义[J]. 解放军医学院学报，2015，36（2）：127-129.

[4] 周琰，李琴，刘皋林，等. 临床（前）研究的质谱流式细胞术——流式细胞技术的“后荧光时代”[J]. 中国新药与临床杂志，2017，34（1）：1-6.

[5] 王宁方，赵崇山，李娟，等. 乳腺癌患者CD45-微泡和单个核细胞的特性及其临床意义[J]. 肿瘤，2016，36（6）：674-682.

[6] 陈建安，周静，朱学海，等. 118例急性白血病五色流式细胞术免疫分型与FAB分型的结果分析[J]. 海南医学，2015，13（1）：56-59.

[7] 张子杰. 结肠癌组织VEGF表达与树突状细胞浸润的临床意义及与血清VEGF浓度及其活化水平的相关性[J]. 中国免疫学杂志，2015，14（9）：1257-1261.

[8] Wu XL，Tu Q，Faure G，et al. Diagnostic and Prognostic Value of Circulating Tumor Cells in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma：A systematic review and meta-analysis[J]. Scientific Reports，2016，26（23）：202-210.

[9] 吕学文，王博，李扬秋. CHOP方案治疗前后外周T细胞淋巴瘤患者外周血 CD45 RA+T 和CD45 RO+T的变化特点[J]. 中国免疫学杂志，2015，24（4）：531-533.

[10] 汪宏梅，张云宁，罗云. 流式细胞学技术检测急性髓细胞白血病患者外周血淋巴细胞亚群的效果分析[J]. 实用临床医药杂志，2017，21（21）：36-38.

[11] 王继英，刘燕，宋振，等. 急性B淋巴细胞白血病患者初发和化疗后微量残留白血病细胞免疫表型的比较[J].检验医学，2016，31（6）：467-473.

[12] 张菊英，张亚衡. 免疫磁珠阳性筛选联合流式细胞术对胰腺癌外周血循环肿瘤细胞的诊断价值[J]. 中国实验诊断学，2016，20（4）：551-554.

[13] 杨志瑞，朱海燕，达万明，等. 急性移植物抗宿主病患者外周血中T细胞功能亚群的变化及临床意义[J]. 中国实验血液学杂志，2015，23（1）：190-194.

[14] 张小芳，孙彩霞，张运刚，等. 急性白血病患者骨髓細胞形态和免疫表型同步检测的比较分析[J]. 国际免疫学杂志，2016，39（5）：442-445.

[15] 唐洁，蒋能刚，梁效功，等. 四色十抗体流式免疫表型分析方案在多发性骨髓瘤诊断中的价值[J]. 华西医学，2017，23（3）：419-424.

[16] Arana P，Paiva B，Cedena MT，et al. Prognostic value of antigen expression in multiple myeloma：A PETHEMA/GEM study on 1265 patients enrolled in four consecutive clinical trials[J]. Leukemia，2017，13（14）：133-140.

[17] 贺继刚， 李洪荣， 桂龙升，等. 小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+/CD45+/CD31+亚群自身抗凋亡基因研究[J]. 安徽医科大学学报，2015，50（12）：1757-1761.

[18] 冯婷婷，甘建和，吴南屏，等. AIDS患者HAART治疗免疫重建过程中检测CD4+CD45RO+/CD45RA+CD127+T细胞的意义及其相关免疫调节分析[J]. 江苏医药， 2016，42（1）：12-16.

[19] 严艳，娄金丽，禇蓓. 不同试剂在流式细胞仪上检测CD45+、CD4+细胞的效果评价[J]. 中国卫生检验杂志，2015，24（22）：3871-3874.

[20] Wang L，Zhai ZW，Ji DB，et al. Prognostic value of CD45RO（+） tumor-infiltrating lymphocytes for locally advanced rectal cancer following 30 Gy/10f neoadjuvant radiotherapy[J]. International Journal of Colorectal Disease，2015，30（6）：734-753.

（收稿日期：2018-02-09）