绵羊FGF5基因Exon 3多态性对毛用性状的影响

张立春 ，尹 峰 ，柳俭强 ，李梦姝 ，3，王春昕 ，曹 阳 ，朴庆林 ，金海国，张明新

（1.吉林省农业科学院畜牧科学分院，公主岭 136100；2.吉林省产品质量监督检验院，长春 750001；3.延边大学农学院，吉林 延吉 130021）

成纤维细胞生长因子5（Fibroblast growth factor 5，FGF5）是FGF家族重要成员之一，在抑制毛囊生长、调节毛囊周期等方面发挥着重要的作用［1］。从具有长毛表型的安哥拉鼠（Angora）到Moja小鼠，遗传学研究均证明长毛表型产生的原因在于基因突变导致FGF5功能缺失所致［1-3］。在包括仓鼠［4］、猫［5］、狗［6，7］、兔［8］、驴［9］，羊驼［10］乃至人类［11］中的研究报道也表明，FGF5基因突变与长毛表型直接相关。表达定位研究表明，FGF5主要表达于毛囊外根鞘，主要通过缩短毛囊周期中生长期来抑制毛发生长［1］。在自然状态下，FGF5基因除转录完整mRNA外，也可通过可变剪切（Alternative splicing，AS）生成中间缺失的FGF5s片段，FGF5s因缺少FGF关键功能结构域，可通过抑制FGF5功能促进长毛性状的产生［5，12］。研究表明，绵羊中同样存在FGF5和 FGF5s［13-14］，人为异位表达FGF5s可促进羊毛生长［15］，通过 CRISPR/Cas9 产生FGF5突变体可显著促进绵羊羊毛生长［16-17］。尽管目前尚未发现自然状态下FGF5缺失突变羊个体的存在，但多个研究表明，绵羊和山羊群体中FGF5基因存在丰富的基因多态性［18-19］，且与毛绒性状存在潜在相关［20-21］。苏博美利奴羊是2014年国内多家单位联合育成的超细型绵羊品种，在羊毛性状，尤其是羊毛细度方面较东北细毛羊，甚至是新吉细毛羊和中国美利奴羊都有显著提升。本文以吉林地区苏博美利奴羊核心群为研究对象，通过检测FGF5基因多态性，分析其与毛用性状的相关性，为全面揭示绵羊毛品质构成的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2个品种绵羊共224只，其中东北细毛羊98只，苏博美利奴羊126只，颈静脉采血10 mL，肝素抗凝，-20℃低温保存。

10×Buffer，dNTPs，25 mM MgCl2，TaqDNA 聚合酶 ，DNA Marker购于天根生化科技有限公司，DNA凝胶回收试剂盒（Axygen）；PMD18-T Vector（TaKaRa）；测序反应交由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因组提取使用 AxyPrep血液基因组提取试剂盒提取，1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存。

1.2.2 引物的设计与合成 参考GenBank数据库绵羊FGF5基因组序列（登录号：KJ647161.1），采用Premier 5.0软件设计Exon 3部分多态性检测引物，引物序列为F：5＇AGAGGGAAGGCTAAACGG3＇，R：5＇AGCGAAACTTGAGTCTGTAT3＇。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2.3 目的片段扩增 PCR反应体系为20 μL：10×PCR Buffer（Mg2+free）2.0 μL，25 mM MgCl21.6 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，上下游引物（10 mmol/μL）各 0.5 μL，dNTPs（10 mmol/μL）1.5 μL，DNA 模板（50～100 ng/μL）1.0 μL，ddH2O 12.4 μL。扩增条件：95℃预变性 5 min，95℃变性 30 s，57℃复性 30 s，72℃延伸 30 s，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 扩增片段测序采用 AXYGEN胶回收试剂盒回收扩增片段，后连接到pMD18-T载体，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂于Amp+抗性LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。挑取阳性克隆经PCR鉴定后送生物公司测序检验是否为目的片段。

1.2.5 PCR-SSCP分析 2.5 μL PCR产物与7.5 μL上样缓冲液［成分同测序缓冲液：98%去离子甲酰胺、0.025%二甲苯菁、0.025%溴酚蓝、10 mmol/L EDTA（pH 值8.0）、10%甘油］混合后PCR仪99℃变性10 min，变性后迅速插入冰中10 min保持变性状态。14%非变性聚丙烯酰胺凝胶过夜电泳，电泳结束后银染显色。

1.2.6 多态性片段测序 通过以上方法检测到的SNP，对其不同基因型个体的PCR产物进行凝胶回收，回收的目的片段连接转化测序。

1.2.7 序列分析与数据处理 使用DNA Star软件分析比对测序结果；使用SPSS 22.0软件进行基因型与羊毛性状的关联性分析。

2 结果与分析

以苏博美利奴羊和东北细毛羊外周血基因组为模板，基因组PCR结果显示，目的条带接近250 bp，条带清晰，无任何非特异性条带及引物二聚体，可直接用于SSCP检测（图1）。未纯化PCR产物经过变性、聚丙烯酰胺凝胶及银染显色，结果显示该片段带型分散，可轻易辨别不同基因型，按照SSCP命名原则将不同带型个体依次命名为 DD、EE、FF、DE 及 EF（图 2），但在 2个群体中并没有发现DF杂合型个体的存在。事实上在东北细毛羊群体中同样没有检测到FF基因型个体的存在（表1）。纯合型个体目的片段克隆测序结果发现，该区域不同基因型是由2个SNP位点组成，分别为g.20977 A-＞G和 g.21029 G-＞C。其中 g.20977 A，g.21029 G-＞C 构成DD、DE、EE基因型。g.21029 G，g.20977 A-＞G构成EE、FE、FF基因型。

另外值得关注的是，本文所检测到的2个突变位点恰好位于绵羊FGF5第3外显子区，CDs位置依次为c.618和c.733（图3），其中c.618突变为无义突变，但c.733突变引起氨基酸三联密码子CTC-＞GTC突变，导致该位点亮氨酸（L）突变为缬氨酸（V），而该突变位点是构成E等位基因型的关键所在。

图1 绵羊FGF5基因组Exon 3区基因组PCR结果

图2 绵羊FGF5基因组Exon 3区SSCP分型结果

图3 绵羊FGF5基因组Exon 3区不同基因型个体SNP位点构成

进一步对2个群体羊的不同基因型、等位基因频率分析发现，DE和EF基因型在苏博美利奴羊群体中频率相对较高，依次为30%和36%，其他包括EE、DD和FF在内的纯合型个体频率含量相对较低，仅FF基因型达到16%；E等位基因频率最高，F次之，D最低（表1）。东北细毛羊群体中各基因型频率分布情况则更为特殊，由于缺乏F等位基因，因此仅检测到DD、DE和EE基因型，其中DE基因型在群体中占主导地位，EE和DD基因型频率则差异不大，并由此推导出D和E等位基因在群体内频率也较为接近（表1）。进一步通过卡方检验来分析2个群体内不同基因型频率之间是否存在Hardy-Weinberg平衡关系。卡方检验结果发现，P值均远小于0.01，提示2个群体FGF5基因均受到高度的选择压力，该结果与2个品种羊在品种选育过程中为提升羊毛性状进行人工选择干预的实际情况相符。

鉴于实验室目前尚没有东北细毛羊相关毛用性状生产数据，本文利用SPSS 22.0软件，采用单因素方差分析方法对不同苏博美利奴绵羊个体FGF5基因Exon 3的基因型与剪毛量、拉伸长度及纤维直径的相关性进行了分析。结果显示，不同基因型个体间羊毛拉伸长度和纤维直径并不存在显著差异性（P＞0.05）（表2），但在剪毛量指标上表现为FF基因型个体显著高于DD基因型个体（P＜0.05）。该结果似乎与其他物种中FGF5基因缺失突变引起长毛的表型不符，但鉴于一方面绵羊中并未发现FGF5基因突变型个体的存在，同时除提前终止的情况外，基因SNP的产生仅可能对基因功能产生微调，并不能起到基因缺失的效果。事实上不同物种FGF5基因多态性与毛绒生产性状关联分析研究也存在不同。有研究证明，绒山羊FGF5基因多态性与山羊绒长度密切相关［20］，但在兔中的研究则存在不同的结果［8，22］。

表1 绵羊FGF5基因Exon 3区基因型频率与等位基因频率

表2 苏博美利奴羊FGF5基因Exon 3区不同基因型与毛用性状相关分析

3 讨论

苏博美利奴羊是近年来国内多家绵羊育种机构历时多年联合攻关育成的超细型绵羊品种，其生产性能在国内，乃至世界均处于较高水平。多项报道表明，不同物种FGF5基因功能缺失导致长毛表型，绵羊中人为突变FGF5同样可产生长毛表型。迄今为止尚未发现绵羊FGF5基因自然突变个体，但研究证明，不同群体绵羊FGF5基因却存在丰富的基因多态性。

本试验PCR-SSCP检验结果发现，苏博美利奴羊和东北细毛羊群体中共存在5种基因型，2个群体共计224只羊中均未发现DF基因型个体的存在，其中值得关注的是东北细毛羊群体中甚至连F等位基因型个体也不存在，由此导致FF纯合型和EF杂合型个体均处于缺失状态。该结果与中国美利奴羊与其他地方绵羊品种FGF5基因Exon 1多态性检测结果相类似［18］，提示以毛用性能为主的细毛羊群体与其他绵羊群体在FGF5基因多态性上可能存在较大差异。相较于其他绵羊品种，东北细毛羊是我国较早育成的半细毛羊品种，苏博美利奴羊也是由东北细毛羊和新吉细毛羊母本与澳洲美利奴羊父本杂交选育而成，两者之间存在间接的血缘关系，东北细毛羊群体F等位基因缺失的情况似乎无法解释，但最可能的原因是F等位基因是澳洲美利奴羊所特有，通过不断杂交选育导入到苏博美利奴羊群体。众所周知，家畜品种杂交选育过程需要经过严格并漫长的后裔测定，筛选与横交固定过程。从2个群体Hardy-Weinberg平衡检验结果就可以证实，2个群体处于极为严格的选择压力之中（表1），由此推测F等位基因在苏博美利奴羊群体伴随着出现及富集的过程。

相关分析发现，苏博美利奴羊群体该区域FF基因型个体在剪毛量上显著高于DD基因型个体（P＜0.05），而产生FGF5蛋白氨基酸位点突变的E等位基因及其杂合型个体在所有指标中与其他基因型并未呈现显著性差异（表2）。该结果似乎与FGF5突变型长毛性状相佐，绒山羊中也证明FGF5基因多样性与绒长度相关，但兔中也有证明该基因多态性与产毛量相关的报道［22］。报道表明，美利奴羊及其杂交群体多性状QTL定位中关于产毛量及纤维直径的BayesR准确性值最高，相应QTL就定位在包括FGF5基因在内的控制毛发生长的基因座位［21］，提示FGF5还可能参与除毛长以外的其他性状构成中。为进一步明确苏博美利奴羊FGF5基因多态性与其产毛性状的关系，应继续扩大群体数量，提高包括毛长度在内的多表性指标测定的准确性，是未来进一步需要开展的工作。当然也可以直接采用新一代包括CRISPR/Cas9在内的基因编辑技术，直接制备FGF5突变型绵羊个体来获取毛长表型，以加快绵羊毛用性状育种进程［16］。