大青叶粗黄酮提取及其抑菌性研究

刘富康，方士元，曲映红

(上海海洋大学 食品科学与工程国家级实验教学示范中心，上海 201306)

大青叶，为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥叶。菘蓝的根入药即为人们平时所俗称的“板蓝根”。大青叶味苦，性寒，具有清热解毒、抗菌抗病毒、增强肌体免疫力等功效[1-2]。有资料显示大青叶提取物具有一定的抑菌作用[3-4]。本文对大青叶粗黄酮提取物进行抑菌能力的研究，旨在为开发绿色安全的天然防腐剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 原料与菌种

大青叶由江西君岭生物科技公司提供；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌由本校食品学院水产品加工试验室-3提供。

1.1.2 主要仪器设备

LLJ-306Z粉碎机，江门市贝尔斯顿电器有限公司；KQ5200E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DSX-280B型手提式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗仪器厂；752N紫外可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；VD-650型桌上式净化工作台，苏州净化设备有限公司；DHP030恒温培养箱，上海试验仪器总厂；ZHWY-103B恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 粗黄酮含量的测定方法

参照王芳和LONDONO[5-6]的方法，并做些许改动。准确称取40 mg芦丁，用70%乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中。取5个25 mL比色管，分别加入0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁溶液，各管中加入70%乙醇3.0 mL和5%亚硝酸钠溶液0.5 mL，混匀放置6min，加10%硝酸铝溶液0.5 mL，混匀放置6min，再加5%氢氧化钠溶液 4.0 mL，混匀放置15min，用80%乙醇定容，以不加芦丁标准溶液作空白对照，在波长510nm处测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。精确称取5 g粉碎并烘干的大青叶，70%乙醇超声浸提，5000 r/min离心5min，将上清液旋转蒸发去除溶剂后，转移至100 mL容量瓶中用70%乙醇定容，得到大青叶粗黄酮提取液，按制作标准曲线的方法测定其吸光度，由线性回归方程计算粗黄酮得率。

1.2.2 大青叶粗黄酮提取工艺优化

通过单因素试验分别考察提取温度(50、60、70、80℃)、提取时间(30、60、90、120min)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)3个因素对大青叶提取物中粗黄酮得率的影响。

在单因素试验的基础上，采用L9(33) 正交试验，以大青叶提取物中粗黄酮的得率为考察指标，对提取温度、提取时间和料液比3个影响因素进行综合考察，进一步优化大青叶中粗黄酮的提取工艺条件。正交试验设计结果如表1所示。

表1 正交试验因素水平设定Table 1 Factors and levels for orthogonal design

1.2.3 乌饭树叶抑菌性试验

1.2.3.1 菌种活化

配制5mL营养肉汤于试管中，高压蒸汽灭菌待用。在无菌操作台上，分别吸取50 μL大肠杆菌、李斯特菌菌种于试管中，37℃摇床培养24 h。

1.2.3.2 菌悬液的制备

将活化好的菌种接种到液体培养基中进行培养，采用菌落计数法制成菌数为1×108个·mL-1的菌悬液。

1.2.3.3抑菌圈试验

分别配制50 mL营养琼脂，高压蒸汽灭菌，待冷却到50℃时进行下一步操作。在无菌操作台上，取已制备的菌悬液50 μL分别加入到营养琼脂中，摇匀，迅速倒入无菌平板中。待营养琼脂冷却凝固以后，在平板上找三个等距的点打孔，分别加入100 μL的大青叶粗黄酮提取液，在37℃恒温培养箱中培养24 h，测定抑菌圈的直径。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线

经线性回归得出芦丁浓度与吸光度值关系曲线的回归方程为y=0.054x+0.0192，R2=0.9714。这表明在一定范围内，该方法线性关系良好，可以用来测定大青叶提取物中粗黄酮的得率。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对粗黄酮得率的影响

由图1可知，随着提取温度的升高，粗黄酮的得率也随之增大。当温度为80℃时，得率达到最大，这可能是由于随着提取温度不断升高，分子运动加快，黄酮的溶解度不断增大，且高温易导致细胞膜破损，有利于有效成分从组织细胞转移到提取溶剂中，增加了有效成分的溶出量[7]。

图1 提取温度对粗黄酮得率的影响Fig.1 Effects of extracting temperature on crude flavonoids yield

2.2.2 提取时间对粗黄酮得率的影响

图2 提取时间对粗黄酮得率的影响Fig.2 Effects of extracting time on crude flavonoids yield

由图2可知，随着提取时间的增加，粗黄酮的得率也随之提升，当提取时间达到90min时，得率达到最高，但继续增加提取时间，粗黄酮的得率反而下降，原因可能是粗黄酮已基本溶出，而在长时间的高温条件下可能会破坏已溶出的粗黄酮[8]，导致得率下降。

2.2.3 料液比对粗黄酮得率的影响

由图3可以看出，随着料液比的升高，粗黄酮的得率也随之升高。当料液比为1∶ 25时，粗黄酮的得率达到最大。继续增加溶剂，费用增加，且粗黄酮得率下降[9]。

图3 料液比对粗黄酮得率的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on crude flavonoids yield

2.3 正交试验结果

由单因素试验得到最好的三个水平分别为提取温度：60、70、80℃；提取时间：60、90、120min；料液比：1∶15、1∶20、1∶25，按照正交试验设计表进行正交试验，结果如表2所示。由表2可知，最佳的提取工艺为A3B3C3，即提取温度80℃，提取时间120min，料液比1∶ 25时大青叶提取物中粗黄酮得率最高。通过表2的极差R分析，三者对粗黄酮得率的影响度为B >C> A，即提取时间>料液比>提取温度。

表2 L9(33) 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

验证试验的结果表明，在正交试验得到的最佳提取工艺条件下重复提取三次，粗黄酮得率平均值为3.62%±0.01%，因此正交试验的结果是准确和稳定的。

2.4 抑菌圈试验结果

抑菌圈试验结果表明，大青叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等有害细菌均有一定的抑制作用。因此，若能有效利用大青叶粗黄酮提取物，将对因大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌感染造成的危害有一定的防范作用。

表3 大青叶粗黄酮对供试菌的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effect of the crude flavonoids from Folium Isatidis

3 结论

采用正交试验优化大青叶中粗黄酮的提取工艺，得到最佳的提取条件为提取时间120min、提取温度80℃、料液比1∶25，该条件下粗黄酮的最大得率为3.62%。

大青叶粗黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌等有害细菌均有一定的抑制作用。大青叶粗黄酮是一种良好的天然防腐剂，值得进一步开发利用。