IR780白蛋白纳米粒的制备、表征及体外抗肿瘤活性研究*

李艳丽 ，孙增先 ，王添艳 ，2，杨广胜 △

（1．徐州医科大学附属连云港医院·连云港市第一人民医院药学部，江苏 连云港 222000； 2．徐州医科大学药物分析教研室，江苏 徐州 221004）

IR780是一种亲脂性阳离子型小分子近红外荧光吸收剂[1]，属于吲哚三碳菁类染料，在吸收波长为780 nm处有最大吸收峰，一般以碘化物的形式存在[2]。相比于其他碳菁类染料，IR780分子结构中引入的氯原子，提高了整个分子的量子产率，且降低了IR780在溶液中的荧光淬灭率和分子聚合反应率，具备深入穿透肿瘤组织内部，靶向聚集于肿瘤细胞内，提高病灶组织的信号对比度等特点[3]。在近红外光照射下，IR780可通过产生的活性氧自由基和大量的热杀死肿瘤细胞，但由于其脂溶性高、体内毒性大，光学性质不稳定，已发生光漂白及生物相容性差等缺点，极大地限制了临床应用。纳米载药系统是将包载的药物靶向运送到特定的肿瘤部位等，降低药物在其他正常组织器官中的分布，具有增强药物溶解性和肿瘤靶向性，提高药效和降低药物毒副作用等特点[4-5]。制备纳米粒的载体材料有很多，其中牛血清白蛋白载药量高、无抗原性、生物相容性好[6-7]。此外，白蛋白纳米粒可通过控制其粒径大小特定靶向于肝脏和肺组织，从而实现肝脏等组织肿瘤的靶向治疗，揭示白蛋白纳米粒作为生物大分子药物载体有着各种潜在的优越功能[8-11]。为增强IR780的水溶性和光热的稳定性，降低其在体内的毒性，本研究中将IR780包载在白蛋白纳米粒中，研究负载IR780白蛋白纳米粒的制备、表征、光热效应及对人的结肠和直肠癌上皮细胞Caco-2体外生长抑制效果，探讨白蛋白作为近红外荧光染料IR780载体的潜在优势，为进一步研究其体内靶向分布和光热治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：JEM-100SX型高分辨透射电子显微镜(日本 JEOL公司）；LS55紫外-荧光分光光度计（美国Perkinelmer）；380ZLS 粒径电位分析仪（Nicomp，美国）；离心机（日立仪器有限公司）；酶标仪（美国Bio-Rad公司）；81-2恒温磁力加热搅拌器 (上海梅颖浦电子仪器有限公司）；MS304T型电子分析天平(德国梅特勒公司）；冷冻离心机 (Centrifuge 5415R，德国 Eppendorf公司），5804R高速冷冻离心机(德国Eppendoff公司）；倒置显微镜 (40CFL Axiovert 40，德国 Carl Zeiss公司）；785 nm激光器（MW-GX-785/2000mW，长春飞秒科技有限公司）。

试药与细胞：IR780碘化物（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号为20170420，纯度为99．9%）；牛血清白蛋白（分析纯，美国Gibco公司，批号为20150703）；95%戊二醛、二甲亚砜、甲醇、无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。优级胎牛血清（美国Gibco公司，批号为20170503）；噻唑蓝（MTT，上海碧云天生物技术有限公司，批号为 20170504）；台盼蓝（批号为T108744），1640 培养基（批号为 20170705），均由徐州博利达生物科技有限公司提供；人结肠和直肠癌上皮细胞Caco-2由中科院上海细胞库提供。

1.2 方法

载IR780白蛋白纳米粒的制备：精密称取一定量IR780和牛血清白蛋白BSA，将IR780先溶于0．2 mL甲醇中，与BSA混溶于3 mL蒸馏水中，超声溶解，向溶液中缓慢滴加pH=9．0的磷酸盐缓冲液，再以2 mL/min的速率滴加无水乙醇，边加边搅拌，加入0．3 mL 8%戊二醛溶液固化6 h，减压蒸馏除去乙醇和甲醇，沉淀用蒸馏水洗涤3次，20 000 r/min高速离心10 min，沉淀真空干燥，得白蛋白纳米粒粉末，低温保存，待用。

白蛋白纳米粒形态和粒径分布观察：取上述条件下制备的白蛋白纳米粒冻干粉，加纯水稀释至1 mL，采用激光纳米粒度仪测定其粒径。另取适量上述白蛋白纳米粒溶液，滴在覆有支持膜的铜网上，2%磷钨酸负染干燥后置透射电镜下拍照，观察其外表形态。

白蛋白纳米粒的载药量和包封率测定：通过紫外分光光度计测定溶液中IR780的含量。配制质量浓度为1．0，2．0，4．0，8．0，10．0，16．0，20．0 μg/mL 的 IR780 溶液，用紫外分光光度计(780 nm）测量其吸光度，并绘制标准曲线。精密称取一定量的白蛋白纳米粒，加入9%醋酸溶液沸水浴2 h，破坏白蛋白纳米粒，得澄清透明溶液，测定IR780的吸光度，并用标准曲线计算IR780的浓度、载药量及包封率。计算公式：载药量=纳米粒中药物的含量/纳米粒的质量×100%，包封率=纳米粒中药物的含量/药物的投药量×100%。通过以下公式计算载药量和包封率。载药量（%）=纳米粒中IR780的质量/纳米粒的质量×100%，包封率（%）=纳米粒中IR780的质量/IR780的投入量×100%。

白蛋白纳米粒的光热效应考察：分别称取一定量的白蛋白纳米粒，按照包载的IR780质量浓度配置成10，20，40，60μg/mL，785nm 激光器照射 5min（1．5W/cm2），观察温度上升情况。

体外细胞毒性试验：取对数生长期的Caco-2细胞，将该细胞悬液按每孔 100 μL（4 ×104/mL）接种至96孔板中，将96孔板置细胞培养箱中培养过夜，设置白蛋白纳米粒±激光照组，然后分别加入不同浓度白蛋白纳米粒和游离 IR780溶液，质量浓度为 0．1，0．5，1．0，2，4，8，10 μg/mL IR780，每个质量浓度设置 6 个复孔，不加药物为空白对照组，培养24 h后终止药物孵育，换用新的培养基，激光照射组用785 nm激光器照射3 min（1．5 W/cm2），继续培养 6 h，然后弃去培养基，每孔加入 MTT 溶液 20 μL（5 mg/mL），4 h 后终止培养，加入100 μL二甲亚砜，振荡10 min，用酶标仪在490 nm波长处测定每孔的吸光度值（OD），细胞的存活率（%）=（OD实验组）/（OD对照组）×100%。

Caco-2细胞台盼蓝染色：取对数生长期的Caco-2细胞，将该细胞悬液按每孔1 mL（5×103/mL）接种至24孔板中培养过夜，对照组为正常的细胞，未加任何干预措施，实验组为加入IR780 5 μg/mL的白蛋白纳米粒，培养6 h后，弃去培养基，PBS清洗3次，加入无血清培养基，785 nm激光器照射3 min，继续培养6 h后，加入胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并适当稀释。然后将细胞悬液与0．4%台盼蓝溶液以9∶1混合均匀（终浓度0．04%），在倒置显微镜下观察细胞染色情况。

2 结果

2.1 白蛋白纳米粒形态和粒径分布

所制备的包载IR780白蛋白纳米粒的透射电镜图见图1，粒径分布见图2。可见，白蛋白纳米粒形态比较圆整，分散性良好、无黏连，可使白蛋白纳米粒在体内有效躲避网状内皮系统的吞噬，并可通过高渗透长滞留效应(EPR）蓄积到肿瘤组织中[12]。粒度分析仪检测结果表明白蛋白纳米粒的平均粒径为（236 ±8．4）nm（n=6）。

图1 透射电镜下白蛋白纳米粒粒径分布(×30 000）

图2 白蛋白纳米粒粒径分布

2.2 白蛋白纳米粒载药量和包封率测定

利用紫外分光光度计测量并绘制IR780的标准曲线，以 UV 吸光度(Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg/mL）为横坐标，得Y=0．077 2X+0．041 5，R2=0．999 7（n=3），表明白蛋白纳米粒质量浓度在1．0～20．0 μg/mL范围内与IR780线性关系良好。测定白蛋白纳米粒中IR780的吸光度值，计算得到 IR780的包封率为（72．43±6．45）%，载药量为（4．38 ±0．35）%。

2.3 白蛋白纳米粒光热效应考察

IR780具有近红外光吸收的升温特性，考察了不同浓度的白蛋白纳米粒的光热升温效果。由图3可见，蒸馏水对照组经过近红外光照射后，溶液温度变化不大，300 s内温度仅升高了3℃；白蛋白纳米粒具有较强的光热效应，随着光照时间的延长，溶液的温度逐渐升高，时间越长温度越高，且随着IR780浓度的增加，温度也逐渐增高，显示白蛋白纳米粒具有较强的浓度依赖性升温效果。此外，60 μg/mL IR780的白蛋白纳米粒经过激光照射后，温度可升高至42℃，据报道，42℃的温度即为杀死肿瘤细胞的致死温度[13]。

2.4 体外细胞毒性试验

图3 白蛋白纳米粒的光热效应考察（785 nm，1．5 W/cm2，5 min）

利用MTT法分别检测游离IR780和白蛋白纳米粒对Caco-2细胞的毒性作用。由图4 A可见，相比于游离IR780组，近红外光照射IR780组对Caco-2的细胞毒性作用增强，表明光热效应可增强IR780对Caco-2的细胞毒性作用。由图4 B可知，与相同浓度的游离IR780相比，白蛋白纳米粒对Caco-2细胞的毒性作用明显增强，随着IR780的浓度不断增大，细胞毒性也随之增加，白蛋白纳米粒对Caco-2细胞的半数抑制浓度(IC50）为（0．456 ±0．2）μg/mL，这可能是由于白蛋白纳米粒增强细胞对IR780的摄取，导致细胞白蛋白纳米粒的细胞毒性作用增强。此外，白蛋白纳米粒经过激光照射后，对Caco-2的细胞毒性作用也进一步增加，细胞生存率明显降低，IC50为0．215 μg/mL，表明近红外光照射可进一步增加白蛋白纳米粒对Caco-2细胞的毒性。

图4 体外细胞毒性研究

2.5 Caco-2细胞台盼蓝染色

台盼蓝是组织和细胞培养中常用的死细胞鉴定染色方法。正常的活细胞，胞膜结构完整，能拒染台盼蓝，使之无法进入胞内，而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，台盼蓝可进入细胞内，显微镜下细胞可被台盼蓝染成蓝色。由图5 A可见，对照组中Caco-2细胞未加任何处理措施，细胞活性正常，拒染台盼蓝，显微镜下细胞外形轮廓清晰透明，而经过白蛋白纳米粒孵育并加激光照射组的Caco-2细胞（图5 B），显微镜下细胞丧失了活性，且细胞膜发生了破裂，整个细胞被台盼蓝染成深蓝色，表明丧失了细胞膜的完整性，Caco-2细胞已经死亡。

图5 Caco-2细胞台盼蓝染色结果（×200）

3 讨论

白蛋白具有生物可降解性、生物相容性等优良性质，可提高难溶性药物的溶解度，避免有机高分子材料在体内的毒性，是纳米载药领域的研究热点，被广泛应用于抗肿瘤药物的包载和纳米粒的制备。本研究中以牛血清白蛋白为载体材料，通过去溶剂化法成功制备出包载IR780的白蛋白纳米粒。此制备方法操作简便，IR780被物理包裹于白蛋白中，与游离的IR780相比，载IR780的白蛋白纳米粒可以提高IR780在水中的溶解度；制备出的白蛋白纳米粒形态圆整，粒径较小，通过激光粒度仪检测，此白蛋白纳米粒的粒径在236 nm波长处。通过近红外光照射后，白蛋白纳米粒具有较强的光热效应，光敏剂IR780通过光热转换效应可产生较强的热量，使溶液温度升高，增强热疗效果。

通过细胞毒性试验发现，白蛋白纳米粒可增强IR780的癌细胞的毒性作用，这可能是一方面由于白蛋白纳米粒能增强细胞的药物摄取，使IR780在细胞内大量聚集释放，充分作用于癌细胞；另一方面，可能是因为白蛋白纳米粒经过近红外光照射后，包载的IR780通过光热转换效应，升高局部温度，通过光热效应，使肿瘤细胞温度达到42℃，从而起到杀死肿瘤细胞的作用。

本研究中成功制备了包载IR780的白蛋白纳米粒并用于肿瘤细胞的治疗研究，为近红荧光染料IR780的传递提供了一种新的药物传递载体。此外，白蛋白纳米粒通过光热治疗的作用方式为以后抗肿瘤治疗提供了一种新的治疗手段和方法。