优化ApoB抗原免疫剂量提高抗体产生的效果

徐志伟，徐一然，陈永霞，刘伟忠，徐小波，于建宁

（1江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，江苏句容212400；2江苏大学土木工程与力学学院，江苏镇江212000；3江苏省句容市动物疫病预防控制中心，江苏句容212400；4江苏省农业科学院畜牧所，南京210014）

0 引言

载脂蛋白(Apolipoprotein,Apo)是来源于血浆脂蛋白中的蛋白[1]，具有稳定脂蛋白的功能，并通过修饰与脂代谢有关的酶活性影响脂肪代谢[2-4]。ApoB与胆固醇共同组成低密度脂蛋白(LDL)，能够识别LDL受体，参与LDL代谢过程[5-8]，所以ApoB对保持体内恒定的血脂水平和介导体内脂类代谢必不可少。基于此，人ApoB的检测在急性冠状动脉综合症、糖尿病等心血管疾病的诊断及后期临床治疗等方面具有重要应用价值[9-10]。测定ApoB能够直接反映低密度脂蛋白的水平，它与Apoa1的比值是动脉粥样硬化等心血管疾病预测和诊断的重要指标。

在动物生物技术中，免疫血清制备是一项常用的技术。通过制备高效价、高特异性的免疫血清可以为免疫学诊断提供试剂，亦可用于医学上特异性免疫治疗或者相关医疗研究。免疫血清的制备也是科研院所免疫学实验的重要内容，是免疫学实验室必不可少的生物制剂。然而目前通过免疫大动物获得免疫血清中的抗体效价并不理想，如何提高抗体效价，是拓宽免疫血清应用的主要限制因素之一。本试验研究通过免疫湖羊不同剂量的ApoB抗原，分析湖羊生产羊抗人血清的效果，通过抗体效价、抗体产生规律和ApoB产品性能检测，获得最佳抗原注射量，为规模化生产奠定基础，同时为增加传统畜牧养殖的经济收益提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验羊：在句容市行香羊场选择健康羊只，年龄10月～1.5周岁，体重40 kg左右湖羊公羊。为利于羊身体健康、试验获得好的效果，对实验羊群采用放牧加舍饲的饲养方法，白天放牧4 h（上、下午各2 h），晚上饲喂精料一次，半个月后开始试验。

试验抗原：ApoB抗原购自上海元升生物科技有限公司，纯度96%。

免疫佐剂：完全弗氏与不完全弗氏佐剂购自Sigma公司。

1.2 试验方法

试验分组：将30只湖羊随机分成3组，每组10只，打上耳标，抗原量分别为组1每次0.2 mg，组2每次0.4 mg，组3每次1.0 mg。

免疫方式：皮下多点注射，注射点分别为腹股沟3个点、肘部2个点、颌下1个点、背侧2个点、耳后1个点，两侧共计16个点。

免疫程序：共计5次免疫。以组1为例，说明免疫程序。

初免：抗原1 mL(2 mg/mL)+9 mL PBS混匀后，与等量10 mL完全弗氏佐剂充分乳化后免疫羊，按16个点均匀注射。第二次免疫为间隔15天后，抗原1 mL(2 mg/mL)+9 mL PBS混匀，与等量10 mL不完全弗氏佐剂充分乳化后免疫羊，按16个点均匀注射。随后进行3次免疫，每次间隔7天，将抗原1mL(2mg/mL)+9 mL PBS混匀后，与等量10 mL不完全弗氏佐剂充分乳化后免疫羊（按16个点均匀注射）。

组2中抗原2 mL(2 mg/mL)+8 mL PBS混匀，组3中5 mL(2 mg/mL)+5 mL PBS混匀，免疫程序与组1相同，共免疫5次，每次按16个点均匀注射。

免疫羊观察：每天观察羊的动态，采食情况，精神状况，做好记录。

抗体检测：随机在3个组合中各挑出5只羊，共15只羊，在免疫前、二免前、三免前、五免后5天分别采血进行ELISA抗体检测，做好记录。

1.3 血清制备

待血液凝固之后，在超净工作台中用无菌滴管把血块剥离瓶壁，37℃放置1～2 h，放入4℃过夜，血清充分析出后经离心沉淀分离出血清，放进低温冰箱保存。

1.4 抗血清效价测定

抗血清效价采用常规的琼脂扩散方法。设定标准阳性血清孔和阴性孔，主要步骤为琼脂板的配制、打孔、补底和加样。

1.5 统计与分析

数据采用分析软件SPSS 17.0进行ANOVA分析，作图SigmaPlot 10.0软件。

2 结果与分析

2.1 免疫羊抗体效价

血清中检测抗体效价，结果（表1）显示：第一次免疫后15天，即第二次免疫前，0.2 mg组抗体效价平均为在1:25.4，随后逐渐升高到1:28.0；0.4 mg组抗体效价明显高于其他2组，五免后的抗体效价能够达到1:28.8；而1.0 mg组抗体效价的整体水平与0.2 mg组较为接近。但3组五免后的抗体效价均达到后续用于制备检测试剂盒或者其他医学用途的抗体水平。

表1 免疫后ApoB多抗血清效价比较

2.2 免疫羊抗体产生规律

图1 不同免疫抗原浓度的抗体效价趋势图

从图1中可以看出，随着免疫次数的增加，血清中抗体效价逐步升高，到五免后抗体效价能够升高到1:26～1:28；而且图中显示0.4 mg组从二免前一直到五免后的抗体效价都要显著高于其他两组，提示最佳的免疫原注射量为0.4 mg/次。注射量较少(0.2 mg)或者较多(1.0 mg)都不利于血清中抗体浓度的升高。

2.3 ApoB产品性能的检测

为了后续制备试剂盒的需要，对血清中的ApoB抗体进行了产品性能的检测，见表2。从外观上看，试剂应为无色透明液体，检验结果符合；试剂分析的灵敏度为0.262 ΔA/(g·L)，合格；试剂空白吸光度≤0.030，符合要求；试剂的准确度亦符合要求。由此可见通过本实验的免疫程序能够成功生产出符合后续试剂盒要求的抗体。

表2 ApoB产品性能的检测

3 讨论

诸多研究表明，ApoB对于医学诊断及疾病治疗具有重要作用。在临床上，检测载脂蛋白A(ApoA)与载脂蛋白B(ApoB)对血脂的判断具有重要意义[8-9]。由于ApoB在体内脂类转运、代谢以及维持血脂水平的恒定中所起的核心作用，所以ApoB的基因变异可能与动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病有必然联系[8,11-12]。另一方面，测定脂蛋白及载脂蛋白对这些疾病发生状态的跟踪与分析意义重大[9,13]。但目前用于检测ApoB的试剂盒尚不成熟。

目前抗血清的商业生产主要应用马、绵羊和山羊等大型家畜，这类家畜具有寿命长、易管理、静脉采集血液方便等优点[10,14]。制备高效价的免疫血清的主要影响因素有抗原自身性质、抗原的注射剂量、注射次数、间隔时间、注射途径及抗原佐剂等[15-17]。免疫剂量的不同导致对免疫系统的刺激强弱存在差异，从而产生不同水平的抗体，进而影响免疫血清的效价[18-20]。本试验从免疫原的注射剂量入手，对免疫剂量进行优化，不但进一步增高了抗体的效价，而且节省了抗原用量，降低了生产成本。

从抗体产生的规律看，3种剂量的抗原都能够产生ApoB抗体，生产趋势一致；抗体表达量以每次0.4 mg的免疫剂量注射时最高，并非我们预猜测的免疫抗原越多越好。为了下一步做检测试剂盒，检测了ApoB的产品性能，从外观、灵敏度、吸光度、准确度等指标进行评价，达到预期水平，可用于后期的商业化生产，具有较高的经济收益。

综上所述，本试验形成了一套制备ApoB抗血清的生产流程，从免疫的具体程序、免疫原剂量的优化到产品性能的检测，具有可重复性，可以在一定范围内加以推广。