神经生长因子对大鼠肝星状细胞转化生长因子—β1及Smad蛋白通路的影响

朱海燕 吴雄健 叶艳清 曾斌 谢志军

[摘要]目的 研究神经生长因子（NGF）对大鼠肝星状细胞-T6（HSC-T6）增殖、凋亡的影响以及大鼠HSC-T6中转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smad蛋白通路的变化，探讨NGF影响 HSC-T6增殖及凋亡的可能作用机制。方法 体外培养大鼠HSC-T6，将HSC-T6与不同浓度的NGF孵育，分为对照组（0 ng/ml NGF）、实验组（100 ng/ml NGF），应用流式细胞术检测HSC-T6凋亡情况，通过XTT法了解NGF对HSC-T6增殖的影响；免疫细胞化学法观察NGF对HSC作用后TGF-β1、Smad3、Smad7表达的变化。结果 实验组（OD值为0.65±0.03）对HSC-T6的增殖抑制作用与对照组（OD值为0.73±0.01）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。实验组的凋亡率高于对照组，差异有统计学意義（P<0.05）。与对照组比较，实验组的TGF-β1、Smad3表达明显降低，Smad7表达明显升高（P<0.05）。 结论 NGF可抑制HSC-T6增殖、促进其凋亡，其机制可能与调节TGF-β1/Smad蛋白通路有关。

[关键词]肝星状细胞；凋亡；神经生长因子；转化生长因子-β1

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）8（c）-0004-04

[Abstract] Objective To study the influence of nerve growth factor （NGF） on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cell-T6 （HSC-T6） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1）/Smad protein pathway change in HSC-T6 of rat， and explore the possible mechanism of NGF influencing HSC-T6 proliferation and apoptosis. Methods HSC-T6 of rat was cultured in vitro. HSC-T6 was incubated with different concentrations of NGF and divided into the control group （0 ng/ml NGF） and experimental group （100 ng/ml NGF）. The flow cytometry was used for detection of HSC-T6 apoptosis. By XTT， the influence of NGF on the proliferation of HSC-T6 was understood. The expression of TGF-β1， Smad3 and Smad7 after NGF affecting on HSC was observed by immunocytochemistry. Results The inhibition of HSC-T6 proliferation in the experimental group （OD value was 0.65±0.03） was significantly different from that in the control group （OD value was 0.73±0.01） （P<0.05）. The apoptosis rate of the experimental group was higher than that of the control group with a statistical difference （P<0.05）. The expression of TGF-β1 and Smad3 in the experimental group was down-regulated significantly， while the expression of Smad7 was greatly up-regulated compared with those in the control group （P<0.05）. Conclusion NGF can inhibit the proliferation of HSC-T6 and promote its apoptosis. The mechanism may be related to the regulation of TGF-β1/Smad protein pathway.

[Key words] Hepatic stellate cell； Apoptosis； Nerve growth factor； Transforming growth factor-β1

肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是慢性肝病进展的中心环节[1]。近期的研究表明，神经生长因子（nerve growth factor，NGF）可诱导HSC凋亡，但其相关作用机制尚未明确。TGF-β1是目前为止公认最强的致肝纤维化细胞因子[2]，HSC TGF-β1/Smads信号通路的激活及其所导致的病理变化在肝纤维化的发生、发展中具有非常重要的作用。本研究主要探讨NGF影响 HSC增殖及凋亡的可能作用机制，寻找防治肝纤维化的新途径。

1材料与方法

1.1 材料

NGF购自美国RD公司；AnnexinⅤ-FITC购自美国罗氏公司；TGF-β1、Smad3、Smad7抗体购自武汉博士德公司；S-P超敏试剂盒（鼠/兔）及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；DMEM培养液及胎牛血清购自美国Gibco 公司。HSC系HSC-T6由上海中医药大学徐列明教授提供，系SV40 转染后的大鼠HSC，具有活化HSC表型。

1.2 方法

HSC-T6的培养与传代：使用 DMEM培养液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素，10%胎牛血清）进行培养。设定培养温度37℃，CO2浓度5%，湿度饱和。予隔天进行1次换液。待细胞密度达80%～90%，以0.02% EDTA和0.25%胰蛋白酶分散细胞，按1∶4传代。根据加入NGF浓度的不同分为对照组（0 ng/ml NGF）及实验组（100 ng/ml NGF）。

1.2.1 NGF对HSC-T6增殖的作用 取对数生长期细胞，细胞悬浮液浓度调至7×104/ml，接种于96孔板中，每孔200 μl，24 h后弃上清，加入各浓度NGF，两组各设4个复孔，培养24 h，而后将预配的 XTT比色液50 μl分别加入各孔，置于培养箱中再孵育4 h。使用酶标仪测定吸光值（OD值），設定主波长570 nm，参考波长690 nm。

1.2.2 NGF对HSC-T6凋亡的影响 取对数生长期细胞，细胞悬液浓度调至5×105/ml，接种于 T-25培养瓶中，24 h后分别加入0 ng/ml及100 ng/ml的NGF培养24 h，收取所有细胞，取1×106洗涤细胞，加入100 μl的结合缓冲液，再加入AnnexinⅤ-FITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2 μl，在室温下避光染色30 min，然后再添加结合缓冲液300 μl，以流式细胞仪检测 HSC凋亡。

1.2.3 TGF-β1、Smad3、Smad7表达的测定 取对数生长期细胞，细胞悬液浓度调配至7×104/ml，滴于预先处理好的置于6孔板内的盖玻片上，每孔0.4 ml，孵育24 h，将培养细胞在0 ng/ml及100 ng/ml的NGF中孵育，并另设不含 NGF的空白对照组，继续培养24 h，然后以4%多聚甲醛固定细胞，分别使用 TGF-β1、 Smad3、 Smad7一抗，应用 SP法进行免疫细胞化学染色，DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树脂封片，在光学显微镜下胞膜或胞浆呈棕黄色的为阳性细胞。每张切片在400×光镜视野下共取10个视野，计数各自阳性细胞所占比例。以各阳性细胞的百分数表示相应蛋白的阳性表达率。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 16.0 统计学软件分析数据，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组细胞增殖情况的比较

实验组NGF与HSC-T6作用24 h后，其OD值为0.65±0.03，与对照组（0.73±0.01）比较，对HSC-T6的增殖具有显著抑制作用，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 两组细胞凋亡情况的比较

实验组NGF作用HSC-T6 24 h后，凋亡率为（26.36±8.51）%，对照组为（6.88±1.35）%，两组比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图1）。

2.3 TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达的变化

实验组的TGF-β1、Smad3阳性表达细胞率分别为（25.26±2.04）%、（30.24±1.52）%，与对照组[（76.24±2.54）%、（59.65±1.25）%]比较，均明显降低（P<0.05），实验组的Smad7阳性表达细胞率为（69.02±3.05）%，较对照组[（26.15±1.20）%]显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）（图2～5）。

3 讨论

肝纤维化是肝硬化的早期病理改变和必经阶段，是由各种致病因素导致的肝脏慢性损伤。目前的研究结果认为，致病因素损伤肝细胞后，Kupffer细胞被激活，分泌出多种细胞因子，共同作用于HSC，最终导致细胞外基质在肝内过量积聚进而形成肝纤维化[3-5]。肝纤维化尚属于可逆性病理变化，但若不及时干预，可进展为肝硬化、原发性肝癌。HSC的活化和增殖是肝纤维化发生、发展进程中的一个关键环节。活化HSC已成为防治肝纤维化的主要靶细胞之一，抑制静止HSC活化、诱导活化HSC凋亡等是防治肝纤维化的一个重要策略[6-7]。

肝纤维化是肝脏组织对各损伤作用进行过度修复的结果。而NGF作为一种重要的组织修复因子，其在肝纤维化的发生、发展中到底扮演着怎样的角色呢？有研究发现，在肝脏受损情况下，肝细胞可表达NGF，用重组体NGF培养HSC，细胞凋亡明显增多，且具有剂量依赖性，该作用可能通过调节NF-κB的活性而实现[8-10]。作者前期研究结果也显示，经 NGF作用的大鼠HSC出现明显的增殖受抑现象以及细胞凋亡形态学改变[11]。NGF可抑制 HSC合成Ⅰ、Ⅲ型胶原，诱导HSC凋亡，因此，抑制胶原分泌可能是NGF抗肝纤维化的作用机制[12]。另有研究表明，NGF可有效阻断由四氯化碳所诱导的小鼠肝纤维化，降低肝脏组织的炎症活动度[13]。

机体内TGF-β异常表达可诱导各种肝病的发生，且在诱导HSC转化为肌成纤维样细胞的致纤维化进程方面，TGF-β的作用尤为显著[14-15]。在向肌成纤维样细胞转变过程中，大鼠HSC中TGF-β1 mRNA的表达水平显著高于 TGF-β2 mRNA和 TGF-β3 mRNA[16]。与TGF-β2、TGF-β3比较，TGF-β1在肝纤维化进程中发挥了更重要的作用。TGF-β1对HSC等细胞的调控作用可通过自分泌和旁分泌的方式实现。TGF-β1在胞外被激活后，可通过特异性受体结合到活化的HSC等细胞胞膜上，继而主要由Smads介导，移位至细胞核，与具有特异序列的DNA相结合[17-18]，调控ECM等因子的目的基因转录并发生高表达，如此推动肝纤维化的发生、发展。其中，Smad2/3作为TGF-β1在胞内主要的信号转导蛋白，负责信息的特异性转导；而Smad7则相反，主要是对该转导通路产生抑制作用[19-20]。TGF-β1/Smads通路在肝纤维化进程中的地位举足轻重，调控该通路以防治肝纤维化应为一种理想的选择。

目前，关于NGF如何诱导HSC凋亡机制的研究较少，而 TGF-β1/Smads是促进肝纤维化进展的重要通路，NGF作为一种修复因子，是否通过此通路诱导HSC凋亡从而发挥抗肝纤维化的作用？本研究发现，NGF可抑制HSC增殖、促进其凋亡，其机制可能为通过上调 Smad7表达、抑制 Smad3表达，最终降低TGF-β1表达水平，为今后进一步研究NGF作用于HSC的相关作用机制提供前期实验基础，为防治肝硬化及肝纤维化提供新路径。

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