缺氧-复氧促进结肠癌LOVO细胞转移及其机制的研究

周程继，王 攀△，喻 晶，魏寿江，王崇树

(1.川北医学院附属医院胃肠外科，四川南充 637000；2.医学影像四川省重点实验室，四川南充 637000)

大肠癌是世界上最常见的恶性消化道肿瘤之一，是导致癌症患者死亡的第四大原因，肿瘤转移是导致患者死亡的重要原因[1-2]。已有研究表明，肿瘤缺氧微环境可促进肿瘤的进展及转移。而目前对于缺氧-复氧(H-R)肿瘤微环境在肿瘤转移方面的研究较少。有研究发现，癌细胞由于不规则的微血管网和血流模式，肿瘤细胞亦处于H-R肿瘤微环境中[3-4]。作者旨在探讨H-R条件下能否促进结肠癌的转移，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 (1)细胞培养和细胞株：人结肠癌LOVO株由陆军军医大学西南医院普外科实验室冻存保留，复苏后培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(美国Gibco公司)，于37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。(2)主要试剂和抗体：二亚苯基碘鎓(DPI)为美国Sigma公司产品，一抗鼠抗人基质金属蛋白酶(MMP)-2单克隆抗体和鼠抗人MMP-9单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，N-乙酰半胱氨酸(NAC)、Western及IP细胞裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒及预染蛋白质分子量标准购自中国碧云天生物技术研究所，Transwell小室为美国Corning 公司产品，BD Matrigel为美国BD-Bio公司产品。

1.2方法

1.2.1H-R养条件的建立 常氧培养组(N组)：细胞培养在95%空气、5%CO2饱和湿度培养箱中培养24 h作为对照。H-R培养条件参照文献[5]进行：LOVO细胞在37 ℃，5%CO2和95%N2的混合气体的三气培养箱中培养4 h；再将细胞放入95%空气、5%CO2的培养箱中复氧培养20 h，即完成H-R培养(H-R组)。

1.2.2活性氧(ROS)的检测 LOVO细胞胰酶消化后，均匀接种培养于96孔板(25×103细胞/孔)，每组设3个重复孔。细胞H-R前分别给予嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂DPI 15 μmol/L(H-R+DPI组)和抗氧化剂NAC 30 mmol/L(H-R+NAC组)预处理1 h。ROS的检测采用荧光探针二氯荧光黄双乙酸盐(DCF-DA)：H-R培养后用不含FBS的DMEM培养基稀释DCF-DA至终浓度10 μmol/L，与细胞37 ℃共同孵育20 min后，用无FBS的DMEM培养液洗涤细胞3次，自动荧光酶标仪(激发波长488 nm；发射波长525 nm)检测细胞内ROS水平。所有测量均在37 ℃进行。

1.2.3伤口愈合实验 LOVO细胞6孔板内培养至80%～90%近单层融合状态，用灭菌的200 μL枪头分别作3条划痕(间距约1 cm)，悬浮细胞用PBS洗净。H-R组伤口愈合实验：DPI 15 μmol/L、NAC 30 mmol/L分别预处理细胞1 h，再行H-R培养。N组作对照。划痕处分别在0、24 h拍照，IamgeProPlus软件计算划痕愈合面积。

1.2.4细胞侵袭实验 Boyden小室(每组3小室)检测细胞侵袭数目：冷的过滤蒸馏水稀释基质胶后，均匀加入到8 μm孔径小室上室。对数期生长的LOVO细胞胰酶消化后计数，无血清培养基调节密度至3×105个/mL，取300 μL细胞悬液加入Boyden小室上部。下室用10% FBS作为趋化物。各实验组细胞分别给予DPI 15 μmol/L和NAC 30 mmol/L预处理1 h，H-R培养后多聚甲醛固定侵袭细胞30 min后，结晶紫染色。N组常规进行。光学显微镜下(×400)随机选择3个区域细胞计数，取平均值，并计算相对于N组的百分比(%)。

1.2.5Western blot分析 用EP管收集细胞悬液后，13 000 r/min离心20 s弃上清液，加入600 μL蛋白裂解液冰上裂解30 min，2 500 r/min离心5 min，上清液移入新的EP管中，BCA法测定蛋白浓度，40 μg总蛋白于10%SDS-PAGE分离蛋白，电转移至硝酸纤维素膜，用含3%BSA封闭液室温下摇动封闭1 h，4 ℃适当稀释浓度的一抗MMP-2，MMP-9及GAPDH 孵育过夜，目的蛋白分子量大小采用预染蛋白质分子量标准判断，化学发光法(ECL)显影免疫反应带进行检测。

2 结 果

2.1各组LOVO细胞ROS水平比较 相对于N组(99.90±9.79)%，H-R组细胞内ROS水平[(270.51±20.32)%]明显升高(P<0.01)；H-R+DPI、H-R+NAC组细胞内ROS水平分别为(67.17±7.46)%、(56.53±3.78)%，与H-R组比较均明显降低(P<0.05)。

2.2各组细胞划痕愈合面积比较 N组、H-R组细胞划痕愈合面积分别为(68.73±2.56)%、(83.30±2.67)%，H-R组LOVO细胞的迁移能力明显强于N组(P<0.05)；H-R+DPI、H-R+NAC组细胞划痕愈合面积分别为(47.37±4.13)%、(30.91±1.15)%，与H-R组比较均明显降低(P<0.05)，见图1。

2.3各组细胞体外相对细胞侵袭数比较 相对于N组(99.67±4.04)%，H-R组细胞侵袭能力[(168.33±8.08)%]明显增强(P<0.05);H-R+DPI、H-R+NAC组相对细胞侵袭数分别为(48.12±2.65)%、(37.33±4.16)%，与H-R组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.4各组LOVO细胞的MMP-2和MMP-9蛋白表达水平比较 与N组比较，H-R组LOVO细胞的MMP-2和MMP-9蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；与H-R组比较，H-R+DPI、H-R+NAC组MMP-2和MMP-9蛋白表达明显下调(P<0.05)，见图3。

A:N组；B：H-R组；C：H-R+DPI组；D：H-R+NAC组

A:N组；B：H-R组；C：H-R+DPI组；D：H-R+NAC组

a：P<0.05，与N组比较；b：P<0.05，与H-R组比较

3 讨 论

有研究表明，局部缺氧是实体肿瘤微环境的一种重要的共同特征，肿瘤细胞暴露于缺氧条件下的可导致肿瘤恶性表型的转化，从而促进肿瘤的转移[6]。LEE等[7]研究发现，实体肿瘤微血管网和血流模式与正常组织间存在较大的差异，这导致肿瘤细胞亦处于H-R的微环境中。

在生理情况下，正常细胞在H-R的微环境中可产生大量的ROS,但产生的ROS可不断被机体的抗氧化系统清除，不致对机体产生严重的组织损伤，从而维持体内氧化还原状态的平衡，其依赖于细胞稳定的氧化还原系统[8]。但肿瘤细胞由于氧化还原系统的缺陷，对ROS的清除能力明显降低，从而导致细胞内ROS的持续升高[9]。而ROS可作为第二信使参与肿瘤的发生、发展，包括肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等多种生物学过程[10]。本研究结果发现，H-R条件下LOVO细胞中的ROS水平明显升高(P<0.05)，在H-R的条件下给予LOVO细胞DPI或NAC处理后ROS的产生明显减少(P<0.05)。以上研究表明，结肠癌细胞在H-R微环境中ROS的表达明显增高，本课题前期研究也得出了类似的结论[5]。同时还发现肿瘤细胞在转移过程中，必须进行细胞形态和体积的变化，以使其通过狭窄外间隙而发生转移[11]。ROS的上调可能导致细胞形态的改变和增强细胞的运动能力[12]。此外，ROS所介导的信号通路，如ROS/ERK信号通路在肿瘤细胞迁移中起着重要作用[13]。因此，本课题通过划痕实验研究H-R条件下抑制ROS的产生对结肠癌细胞迁移的影响。伤口愈合和侵袭实验进一步观察结果显示，H-R处理后结肠癌细胞的转移潜能明显增强，但是这种作用可被DPI或NAC消除，与H-R组比较差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明结肠癌细胞在H-R微环境中可促进肿瘤的迁移能力，这种促进作用可能是通过提高细胞内ROS的产生而实现。

MMPs几乎能降解细胞外基质(ECM)中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在癌细胞的侵袭和转移中发挥着重要的作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶[14]。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的非常重要的两个成员，二者是导致大肠癌患者肿瘤转移中的重要因素[15]。本研究发现，在H-R条件下LOVO细胞MMP-2和MMP-9蛋白的表达明显上调，结肠癌细胞的侵袭能力明显增强，从而表明MMP-2和MMP-9蛋白可能参与了结肠癌细胞在H-R微环境中的侵袭、转移过程。进一步实验发现，采用ROS的抑制剂DPI和NAC分别处理H-R组细胞后，结肠癌LOVO细胞的MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。因此，本研究认为，MMP-2和MMP-9可作为ROS的下游信号分子参与结肠癌细胞的侵袭、转移过程，可通过抑制ROS的产生来阻止结肠癌的转移过程。

综上所述，H-R肿瘤微环境在结肠癌的转移中发挥着重要的作用，其作用可能是通过提高细胞内ROS的产生而实现，ROS/MMPs信号通路在H-R微环境中可能对结肠癌的转移发挥着重要的促进作用，而其深入的机制还有待进一步的研究。