上皮性卵巢癌原发灶和转移灶中miRNA-124表达水平的研究

何 喻，任 莹，丛玲华

(宁波市鄞州人民医院病理科，浙江 宁波 315000)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌最主要的病理分型，占80%以上。EOC发病隐匿、恶性程度较高、生存率较低，是女性生殖系统肿瘤致死率最高的疾病[1]。临床上，大约有75%的ECO患者到医院就诊时已经处于Ⅲ期或Ⅳ期，并且5年生存率也仅30%左右[2]。MicroRNA (miRNA)由18～22个核苷酸组成，是非编码RNA分子，转录后调节基因的表达[3]。既往有研究发现，卵巢癌组织中有多种miRNA异常表达，例如浆液性卵巢癌组织中miRNA-200、miRNA-429、miRNA-7、miRNA-124等。miRNA-124是近年来研究较多的miRNA之一，其在肝癌、胃癌、大肠癌、口腔癌和宫颈癌中表达水平下降，发挥着类似抑癌基因的作用[4-6]。miRNA-124可以调控表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)，从而对肿瘤的增值、侵袭起到抑制作用[7]。目前，关于miRNA-124与EGFR在卵巢癌中表达的报道比较少。本研究采用显色原位杂交(chromogenic in situ hybridization，CISH)技术检测了卵巢癌原发灶及转移灶中miRNA-124的表达水平，另外采用免疫组化技术检测了EGFR的表达水平，旨在探讨miRNA-124与EGFR在上皮性卵巢癌中表达的相关性，以及其与癌症转移的关系。

1资料与方法

1.1一般资料

2016年5月至2018年3月于宁波市鄞州人民医院进行手术治疗的EOC患者60例，均经过术后病理检查证实EOC的诊断。根据国际妇产科联盟(The International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期：Ⅲ期28例，Ⅳ期32例。ECO患者转移灶均为大网膜或者腹膜转移结节。患者术前均未接受过放、化疗和(或)激素治疗。

1.2方法

1.2.1 miRNA-124水平的检测

采用CISH法检测miRNA-124的表达。组织标本采用10%福尔马林固定、石蜡包埋，切片厚度为4μm。检测时进行脱蜡和水化处理，并进行柠檬酸盐抗原修复，100℃烤箱中孵育10min，随后使用蛋白酶K(上海翊圣生物科技有限公司，货号10401ES60)消化和脱水，杂交过夜，使用DAB(试剂盒购于武汉博士德有限公司，货号AR1025)进行显色，再使用苏木素复染，最后采用中性树胶封片，显微镜下观察。miRNA-124阳性时镜下显示黄色或棕黄色颗粒样物质。

1.2.2 EGFR蛋白的检测

链霉素-过氧化物酶免疫组化法检测EGFR蛋白的表达，试剂盒购于上海经科化学科技有限公司，货号为WB1210-1。检测时进行脱蜡和水化处理，随后进行抗原修复，每张切片加50μL过氧化物酶阻断液(试剂A)，温室孵育10min，再加50μL非免疫性动物血清(试剂B)，温室孵育15min。之后每张切片加50μL生物素标记的二抗(试剂C)，温室孵育1h，加50μL试剂D，温室孵育10min，使用DAB进行显色，用苏木素进行复染，最后使用中性树胶封片，显微镜下观察。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0进行统计学分析，计数资料采用例(百分比)表示，组间比较采用卡方(χ2)检验；相关性检验采用Spearman分析，P<0.05为组间差异有统计学意义。

2结果

2.1 EOC原发灶和转移灶中miRNA-124的表达

如图1和表1所示，46(76.67%)例原发灶中miRNA-124表达阳性，18(30.00%)例转移灶中miRNA-124表达阳性，miRNA-124在原发灶中的表达率明显较转移灶高，差异有统计学意义(P<0.001)。原发灶和转移灶中EGFR的的阳性表达率均为100.00%，原发灶中强阳性(+++)表达率较转移灶低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1和表1。

2.2 miRNA-124表达与EGFR表达的相关性分析

miRNA-124和EGFR在原发灶和转移灶中的表达量呈负相关(P= 0.021)，见表2。

注：A为miRNA-124在EOC原发灶中的表达(×200)；B为miRNA-124在EOC转移灶中的表达(×200)；C为EGFR在EOC原发灶中的表达(×200)；D为EGFR在EOC转移灶中的表达(×200)

图1 EOC原发灶和转移灶中miRNA-124的表达

Fig.1 Expression of miRNA-124 in EOC primary foci and metastatic foci

表2 miRNA-124和EGFR在原发灶和转移灶中表达的相关性[n(%)]

3讨论

3.1 miRNA-124的生物学功能

miRNA在机体内发挥着重要的生物学功能[8]。近年来研究发现，miRNA在肿瘤的发生和发展中起到重要作用，并且对肿瘤的诊断和预后的判断也有意义[9]。作为新型的分子标志物，miRNA可用于肿瘤的早期诊断，其具有广阔的应用前景[10-11]。既往研究发现，miRNA-124是神经系统发育过程中必不可少的miRNA之一[12]，miRNA-124在多种肿瘤组织或外周血中的表达水平下降，对细胞的增值、分化、迁移和侵袭起着重要作用[4-5,13]。舒锦等[14]发现卵巢癌组织中的miRNA-124表达水平下降。体外实验中，miRNA-124 在卵巢癌 SKOV3 细胞中过表达可明显抑制该细胞的增殖、 迁移和侵袭，并且促进细胞凋亡。

3.2 miRNA-124在卵巢癌组织中的表达水平及意义

目前，检测miRNA的方法主要有miRNA芯片法、聚合酶链反应技术和Northern blot技术等，均有较高的特异度和敏感度，但是它们不能显示miRNA在组织中的定位。CISH是一种新的组织化学方法，可以评估基因的扩增水平，并且灵敏度较高。本研究采用CISH技术，通过miRNA-124互补的核苷酸探针，显示出miRNA-124在卵巢癌组织中的位置，对其进行定位观察，结果发现，46(76.67%)例原发灶中miRNA-124表达阳性，18(30.00%)例转移灶中miRNA-124表达阳性，miRNA-124在原发灶中的表达率明显较转移灶高(P<0.05)。结果提示miRNA-124的表达与EOC的转移能力呈负相关(P<0.05)，miRNA-124可能对EOC的转移起到抑制作用。

3.3 miRNA-124对EGFR的影响及意义

既往研究已证实，EGFR与肿瘤的转移有关，约70%的EOC有EGFR的表达[15]。有学者发现，抑制EGFR可以抑制卵巢癌的转移[16]。miRNA被认为可以促进或抑制肿瘤的转移，其机制可能与EGFR、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和E-cadherin等表达有关。有研究发现，miRNA-124可以调控EGFR，从而对肿瘤的增值、侵袭起到抑制作用[7]。有报道指出，miRNA-124可以通过与EGFR mRNA的3个非保守的区域结合，使得AKT和ERK1/2这两个EGFR信号通路的关键分子下调，在多种人类肿瘤细胞中引起周期阻滞和细胞死亡[17]。体外研究中，过表达miRNA-124可以激活EGFR-P13K-ATK信号通路，促进癌症的侵袭和转移[18]。本组研究发现，原发灶及转移灶中EGFR的表达率均为100.00%，原发灶中强阳性(+++)表达率较转移灶低。并且，miRNA-124和EGFR在原发灶和转移灶中的表达量呈负相关。

综上，miRNA-124在EOC原发灶和转移灶中的表达有所差异。miRNA-124可能通过靶向EGFR调节EOC的转移，其可能成为治疗EOC潜在靶点，但是具体作用机制还需要进一步体内外研究。