高效液相色谱测定番茄制品中的三种功能性脂肪酸

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(1.四川省农业科学院农产品加工研究所,四川成都 610066; 2.四川大学华西公共卫生学院,四川成都 610041)

番茄(LycopersicumesculentumMill.)属于茄科番茄属。番茄的果实圆润光滑、多汁,营养十分丰富,番茄中不仅含可溶性糖、蛋白质、膳食纤维和多种矿物质元素,还含有番茄红素、胡萝卜素、维生素 C 和维生素 A 等多种功能活性物质。研究表明,番茄及其制品对“三高”有一定疗效和预防作用,这是因为除了人们熟知的番茄红素[1-2],还有另外2类鲜为人知的具有降“三高”的活性物质γ-氨基丁酸[3]和功能性脂肪酸[4]。日本科学家首先在番茄制品中发现了多种功能性脂肪酸[5],包括9-羰基-10(E),12(Z)-十八碳二烯酸(9-oxo-10(E),12(Z)-octadecadienoic acid,9-E,Z-KODE)、9-羰基-10(E),12(E)-十八碳二烯酸(9-oxo-10(E),12(E)-octadecadienoic acid,9-E,E-KODE)、13-羰基-9(Z),11(E)-十八碳二烯酸、13-羰基-9(E),11(E)-十八碳二烯酸、13-羰基-9(Z),11(E),15(Z)-十八碳三烯酸和9-羰基-10(E),12(Z),15(Z)-十八碳三烯酸,这些不饱和脂肪酸衍生物属于过氧化物酶体增殖物,可激活受体蛋白(peroxisome proliferator activated receptors,PPARs)的产生。PPARs是一类由配体激活的核转录因子,与脂肪细胞分化有关[6],并具有促进单核细胞/巨噬细胞分化的作用[7],其可分为α、β、γ3种类型,其中PPAR-γ作为核转录受体家族成员,在脂肪细胞分化、肥胖和糖尿病中具有重要的作用[8]。

9-羟基-十八碳二烯酸(9-hydroxy-octadecadienoic acid,9-HODE)为PPAR-γ天然配体中的一种,属于氧化低密度脂蛋白脂肪酸衍生物,在动脉粥样硬化过程中,其对巨噬细胞基因表达的调控起到关键作用[9]。HODEs 还可诱导巨噬细胞释放白介素1β[10],白介素1β是促炎细胞因子,可激活与炎症、自身免疫疾病等有关基因的表达[11-13]。此外,功能性脂肪酸还对人卵巢癌细胞(HRA)有细胞毒性作用。研究表明,9-E,E-KODE通过线粒体调控诱发HAR癌细胞的凋亡[14],9-E,E-KODE对培养72 h的人卵巢癌细胞的抑制活性是9-E,Z-KODE抑制活性的10倍[15]。PPAR-γ的配体广泛,包括天然和合成的配体。合成的配体药物有噻唑烷二酮类,包括曲格列酮、罗格列酮等[16]。但是,化学合成的药物存在副作用,长期服用会对身体造成一定损害。因此,天然的、有效的来自食品的降脂、降糖产品受到人们的极大关注。

目前国内外对番茄中活性成分的研究多集中在番茄的类胡萝卜素、酚类化合物以及一些脂肪酸衍生物,但对番茄中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的研究较少。本研究拟建立高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)法同时测定番茄制品中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE这三种功能性脂肪酸含量的方法,并用高效液相色谱-质谱技术(High performance liquid chromatography-mass spectrometry,HPLC-MS)鉴定这三种活性成分;同时应用该色谱方法检测新鲜番茄、市售番茄汁、市售番茄酱和自制番茄酱中这三种活性成分的含量,以期为番茄中功能性脂肪酸的进一步研究提供基础,并对开发优质番茄制品提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜番茄、番茄酱、番茄汁 购于成都好家乡超市;自制番茄酱 由四川省农业科学院农产品加工研究所功能食品研究室研制;9-HODE 纯度≥98%,美国Cayman Chemical公司;9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE 纯度≥98%,由本课题组从玛咖中分离得到。

1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦公司;TSQ QUANTUM ULTRA型液相色谱质谱仪 美国热电公司;KH2200DE型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品溶液的制备 分别称取0.98 mg 9-HODE、4.6 mg 9-E,Z-KODE和7.3 mg 9-E,E-KODE,分别用甲醇溶解,并定容至10 mL作为标准品母液。采用梯度稀释法,用甲醇将各标准品母液配制成一系列浓度梯度的标准品溶液(见表1),备用。

表1 三种功能性脂肪酸标准曲线的浓度梯度Table 1 The concentrations of three functional fatty acid for standard curves

1.2.2 样品溶液的制备 自制番茄酱样品的制备:选取新鲜成熟的番茄,洗净,破碎,打浆,40 ℃搅拌4 h,过滤(筛孔直径0.8～0.9 mm),60 ℃减压浓缩至固形物含量为22%～24%,100 ℃沸水杀菌30 min,冷却,装瓶。

新鲜番茄样品制备:选取新鲜成熟的番茄,洗净,破碎,打浆。

样品中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的提取:番茄样品(新鲜番茄、市售番茄汁、市售番茄酱、自制番茄酱),冷冻干燥(真空度30 Pa,冷阱温度-50 ℃,冷冻时间24 h)。称取1 g干燥样品粉末于磨砂口锥形瓶中,加入10 mL甲醇,盖塞,称重,40 ℃超声1 h,冷却,以甲醇补齐重量,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,待测。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm);DAD检测器,检测波长:234 nm(9-HODE)和280 nm(9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE);柱温:40 ℃;流速:1.0 mL/min;进样量20 μL;流动相:0.005%的三氟乙酸水溶液(A)+0.005%的三氟乙酸乙腈溶液(B)。梯度洗脱:0～20 min,55%～78% B;20～25 min,78%～100% B。

1.2.4 HPLC-MS分析条件 此部分试验送检至四川大学分析测试中心完成。色谱条件:流动相A和B分别为0.1%甲酸水溶液和乙腈,流速0.3 mL/min,柱溫:30 ℃,进样量:0.2 μL。梯度洗脱条件:0～40 min,35%～100% B;40～45 min,100% B。

质谱条件:MS采样速率:1 spectra/s;MS采样范围:50～500 m/z;扫描范围:190～500 m/z;紫外检测波长234 nm(9-HODE)和280 nm(9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE)。离子源为电喷雾离子源,离子源温度:325 ℃,检测方式为多反应检测,鞘气流速:9.0 L/min,鞘气温度:350 ℃,毛细管电压:3500 V。

1.3 数据处理

所有数据均为3次重复实验的平均值,应用Microsoft Excel 97-2003对数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC-MS分析

在HPLC-MS分析番茄甲醇提取物成分时,采用的是负离子检测方式。根据总离子流色谱峰上所得到的准分子离子峰，确定化合物的相对分子质量(图 1),并与对照品的色谱保留时间和紫外吸收特征进行对比,从而鉴定出9-HODE(tmin21.69)、9-E,Z-KODE(tmin23.76)和9-E,E-KODE(tmin24.49)3个化合物,其分子量分别为296.2、294.2和294.2。此前,未见文献报道过9-HODE存在于番茄或番茄制品中。

图1 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的自制番茄酱负离子模式质谱图Fig.1 MS profiles of 9-HODE,9-E,Z-KODE and 9-E,E-KODE in tomato products注:a:9-HODE;b:9-E,Z-KODE;c:9-E,E-KODE。

2.2 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的标准品和番茄样品的HPLC色谱

3种功能性脂肪酸标准品与自制番茄样品的HPLC色谱图见图2。在优化好的色谱条件下,9-HODE最大紫外吸收波长在234 nm。9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE是同分异构体,最大紫外吸收波长280 nm左右,在此条件下9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE完全分离,分离度均大于1.5,分离效果良好,且目标峰形尖锐,对称性好。因此本方法适合3种功能性脂肪酸的测定。

图2 标准品和番茄样品的HPLC色谱图Fig.2 The HPLC chromatograms of standards and samples注:标准品图谱(A、B),自制番茄酱(C、D),A、C检测波长234 nm、B、D检测波长280 nm; 1、2、3分别是9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线和线性关系 以峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,由表2可知,9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE标准品质量浓度和相应峰面积的线性关系良好。

表2 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的保留时间和线性关系Table 2 Retention time and linear relationship of 9-HODE,9-E,Z-KODE and 9-E,E-KODE

2.3.2 精密度试验 取9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE标准品混合液20 μL，以1.2.3的色谱条件,连续进样5次,计算色谱峰面积,结果显示,9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)分别为0.11%、0.70%和0.35%,表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 按照1.2.2的方法提取自制番茄酱5份,以1.2.3的色谱条件进行色谱测定分析,测定色谱峰面积,结果显示9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE的RSD分别为0.19%、2.13%和0.70%,表明试验方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取3种混合标准品以1.2.3的色谱条件,分别在时间为0、2、4、6、8 h进样,计算9-HODE、9-E,Z-KODE、9-E,E-KODE峰面积,RSD分别为0.34%、0.98%和0.40%,表明试验稳定性良好良好。

2.3.5 加样回收率实验 准确称取5份自制番茄酱,分别加入一定量的9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE标准品,以1.2.2的方法制备样品,再按1.2.3的色谱条件进行分析。结果显示(表3),9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的平均加标回收率分别为99.78%、99.70%和99.39%,RSD分别为2.90%、3.24%和3.38%,表明试验方法有较好的回收率,回收结果准确可靠。

表3 9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE回收试验结果(n=6)Table 3 Recovery tests for 9-HODE,9-E,Z-KODE and 9-E,E-KODE(n=6)

回收率计算公式:Y(%)=(A-B)/C×100

式中,Y:回收率;A:实测值;B:样品含量;C:加入标准品含量。

2.4 不同番茄制品中3种功能性脂肪酸的含量结果及讨论

由表4可知,新鲜番茄中均未检测到9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE,而在自制番茄酱中检测到三种化合物,这表明这三种化合物的产生可能与加工、储藏过程中相关酶的激活有关。亚油酸经脂质氧化过程得到HODES,2009年Levandi等[17]发现,小麦贮藏过程中有HODEs形成,Püssa等[18]发现,在畜禽肉在贮藏过程中产生大量亚油酸的氧化产物,其中包括HODEs,某些产品中HODE高达1000 μg/g,且有研究表明,在各种氧化试验中9-HODE均表现出良好的稳定性[19]。此外,市售番茄汁、市售番茄酱和自制番茄酱中均检测到9-HODE,但自制番茄酱中含量远高于市售番茄汁和番茄酱中,这可能是加工手段、储藏时间等造成的差异。

表4 不同番茄制品中9-HODE、9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE的含量Table 4 The contents of 9-HODE,9-E,Z-KODE和9-E,E-KODE in different tomato products

9-E,Z-KODE仅在自制番茄酱中存在,9-E,Z-KODE产生于制造番茄酱的过程中,但其可能不稳定,易分解或者转化。Dufour C等[20]研究指出,由脂肪氧化酶催化亚油酸氧化产生的9-E,Z-KODE,再经过异构化转化为9-E,E-KODE,但在KODE同分异构体积累过程中,则以如下顺序积累:9-E,E-KODE>13-E,E-KODE>13-Z,E-KODE>9-E,Z-KODE,且在30 h内,9-E,E-KODE含量随时间延长逐渐超过9-E,Z-KODE含量。本次试验中,自制番茄酱中9-E,Z-KODE含量远高于9-E,E-KODE,可能是番茄酱自制初期,9-E,Z-KODE还未大量转化成9-E,E-KODE。9-E,E-KODE在新鲜番茄和市售番茄酱中均未检测到,在市售番茄汁和自制番茄酱中含量较接近。但就9-E,Z-KODE会转化成9-E,E-KODE这一推论,自制番茄酱中9-(E,E)-KODE含量将逐渐增加,并超过市售番茄汁中的含量,这也表明,9-E,E-KODE含量不仅与储存时间有关,还受到加工手段的影响。

3 结论

通过高效液相色谱-质谱技术(HPLC-MS)鉴定出番茄制品中含有9-羟基-十八碳二烯酸、9-羰基-10(E),12(Z)-十八碳二烯酸、9-羰基-10(E),12(E)-十八碳二烯酸3种功能性脂肪酸,并建立高效液相色谱法检测这三种化合物的方法,该检测方法耗时短(20 min),重复性好(RSD≤2.13%),精密度高(RSD≤0.70%),稳定性好(RSD≤0.98%),回收率准确可靠(RSD≤3.38%)。以此色谱条件检测4个番茄样品(新鲜番茄、市售番茄汁、市售番茄酱和自制番茄酱)中三种化合物的含量,结果表明,新鲜番茄中均未检测到这三种化合物;9-HODE在市售番茄汁、市售番茄酱和自制番茄酱中含量均较高,其中在自制番茄酱中含量高达34.84 μg/g,且是首次在番茄制品中发现;9-E,Z-KODE仅在自制番茄酱中检测到;9-E,E-KODE仅在市售番茄汁和自制番茄酱中检测到。