蓝莓果渣花色苷提取工艺优化及抗氧化活性比较研究

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(1.贵州茅台(集团)生态农业产业发展有限公司,贵州丹寨 557500; 2.贵州理工学院食品药品制造工程学院,贵州贵阳 550007; 3.江南大学生物工程学院,江苏无锡 214122)

蓝莓是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生落叶或常绿灌木浆果植物[1],含有丰富的花色苷[2]。贵州野生蓝莓资源丰富,2013年蓝莓种植面积已达到3880 hm2,年产量为3000 t[3]。蓝莓果渣为蓝莓经过压榨生产果汁后的副产物,富含花色苷、黄酮醇、绿原酸等功能性保健成分[4],花色苷是一种天然水溶性色素,具有抗氧化、抑菌[5]和抑制癌细胞等活性,是迄今为止所发现的最有效的天然水溶性自由基清除剂[6],因此富含花色苷的蓝莓果渣可作为功能性食品和保健品很好的天然原料,有一定的研究价值[7]。

目前对蓝莓果渣的开发利用主要围绕多酚(尤其是花色苷)、膳食纤维开展的,其中以超声提取蓝莓果渣中花色苷研究最多,评价指标多以花色苷含量为主,对蓝莓果渣不同提取工艺的比较鲜有报道,且缺少量(总多酚含量、花色苷含量)和质(抗氧化活性)相结合的对比评价[3],不能科学的、全面的为工业化大规模开发利用蓝莓果渣提供依据。

本研究以蓝莓干果渣为原料,酸化乙醇为溶剂,采用超声辅助提取工艺,以花色苷含量为评价指标对提取工艺进行优化。在此条件下,对比了相同干重的蓝莓干果渣、湿果渣分别各自采用超声辅助提取、无超声辅助工艺的提取液的总多酚、花色苷含量及抗氧化活性。为后续工业化开发利用蓝莓果渣提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓果渣 贵州茅台(集团)生态农业产业发展有限公司提供;没食子酸(标准品) 中检所;磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、三氯乙酸、铁氰化钾、硫酸亚铁、双氧水、无水乙醇、酒石酸、氯化钾、醋酸钠、冰醋酸、抗坏血酸、盐酸等 均为国产分析纯;实验用水 均为蒸馏水。

0～100%vol酒精计(三支组) 河北省武强县同辉仪表厂;PHSJ-4A型pH计 上海盛磁仪器有限公司;DSH-UV-5500(PC)紫外/可见分光度计 上海元析仪器有限公司;DJ-A500型电子天平 福州华志科学仪器有限公司;JY-500A2型高速粉碎机 浙江省永康市松青五金;WGL-203B型数显电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;SM-1200D型超声波破碎仪 南京舜玛仪器设备有限公司;XODL-2020型低温恒温冷却泵 南京先欧仪器制造有限公司;HJ-1型磁力搅拌器 天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂;HH.S21-Ni4型恒温水浴锅 北京科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 蓝莓干果渣:将蓝莓压榨果汁后的蓝莓果渣冷冻运输至实验室,在实验室经室温自然解冻、55 ℃烘箱烘干至恒重,粉碎过60目筛处理,备用;蓝莓湿果渣:将蓝莓压榨果汁后的蓝莓果渣冷冻运输至实验室,自然解冻,备用。

1.2.2 蓝莓干果渣花色苷提取工艺 取一定量的蓝莓干果渣,以一定量的一定pH的酸化乙醇(采用1 mol/L HCl溶液调整pH)为提取溶剂,用一定功率超声提取一定的时间,抽滤,取滤液(即提取液)进行花色苷含量的测定。

1.2.3 Plackett-Berman试验设计 以蓝莓干果渣为原料,运用Minitab 15软件进行N=11的Plackett-Berman设计,以花色苷含量为指标,对乙醇pH、乙醇浓度、液料比、超声功率、提取时间5个因素显著性进行考察。每个因素取高(1)、中(0)、低(-1)3个水平,虚拟值与真实值对照表见表1。

表1 Plackett-Berman实验因素水平设置Table 1 Level setting of experimental factors of Plackett-Berman

1.2.4 最陡爬坡(Steepest Ascent)试验 最陡爬坡(Steepest Ascent)试验用以确定各显著因素的最佳响应水平,以各因素对响应值的贡献效应,按照响应值梯度增加为爬坡方向,进行最陡爬坡试验设计,能最快、经济地逼近提取液中花色苷含量最高的水平区域。Plackett-Berman试验结果显示乙醇浓度、液料比和乙醇pH 3个因素较为显著,根据3个因素对响应值的贡献的正负效应确定各因素爬坡步长为:乙醇浓度取+5,液料比和pH的依次取-5、-0.5,超声功率固定为500 W,提取时间固定为20 min。在爬坡试验中,乙醇浓度起始参数为50%,液料比起始参数为45 mL/g,乙醇pH起始参数为4。

1.2.5 响应面法优化提取工艺 运用Design Expert软件,根据Box-Benhnken法设计原理[8],继续设计3因素3水平的响应面实验,各因素的虚拟值和真值之间的对照见表2。

表2 响应面设计的因素及水平Table 2 Factors and levels of Response Surface Design

1.2.6 花色苷的测定方法 采用双波长pH示差法,取两份提取液0.4 mL,分别加入pH4.5的缓冲溶液(0.4 mol/L醋酸钠溶液)和pH1.0的缓冲溶液(0.25 mol/L氯化钾溶液)3.6 mL(稀释因子D=10),摇匀,静置15 min,转入光路为1 cm的比色皿中,以蒸馏水代替样品溶液做空白对照,分别在520和700 nm波长处测定吸光度。花色苷含量计算公式如下[9-10]:

其中:Y为花色苷含量,以每克果渣中含有的矢车菊-3-O葡糖苷毫克数计,mg/100 g;ΔA为吸光度,ΔA=(A520 nm pH1.0-A700 nm pH1.0)-(A520 nm pH4.5-A700 nm pH4.5);MW为矢车菊花青素-3-O-葡萄糖苷的分子量,449.2 g/mol;D为稀释因子,10;V为最终抽滤后的滤液的体积,mL;为蓝莓果渣重量,g;ε为矢车菊花青素-3-O-葡萄糖苷的摩尔消光系数,26900 L·cm-1·mol-1;L为光路长,cm。

1.2.7 蓝莓干果渣、湿果渣提取液的制备 经测定蓝莓湿果渣含水量约为60%,按照上述优化的工艺条件下,对比同样干重的蓝莓干果渣和蓝莓湿果渣分别采用超声辅助提取和无超声辅助提取,提取液中的总多酚和花色苷含量及抗氧化活性。

超声辅助提取:称取蓝莓干果渣1 g,加入30 mL浓度为60%,pH为3的乙醇,超声功率为500 W,提取20 min,制备蓝莓干果渣提取液A;称取蓝莓湿果渣2.5 g,加入28.5 mL浓度为60%,pH为3的乙醇,超声功率为500 W,提取20 min,制备蓝莓湿果渣提取液B。

搅拌浸提:称取蓝莓干果渣1 g,加入30 mL浓度为60%,pH为3的乙醇,搅拌提取20 min,制备蓝莓果渣提取液C;称取了蓝莓湿果渣2.5 g,加入28.5 mL浓度为60%,pH为3的乙醇,搅拌提取20 min,制备蓝莓果渣提取液D。

1.2.8 总多酚的测定方法 标准曲线制作:准确称取5 mg没食子酸,用纯净水溶解,定容至10 mL,分别移取0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.8、2.1、2.5、2.9 mL到10 mL容量瓶中,加水定容,其中没食子酸的浓度分别为20、25、30、35、40、45、90、105、125、145 mg/L。分别取不同浓度的标准溶液1.0 mL,加入5.0 mL 0.2 mol/L Folin-Cioealteu试剂混合,在0.5～8 min内加入4 mL 7.5%(w/v)碳酸钠溶液,充分混合。将上述混合标准溶液在25 ℃下避光放置2 h后,在765 nm波长下测定吸光值。以吸光度Y为纵坐标,没食子酸浓度X为横坐标,绘制标准曲线。标准曲线为:y=0.0113x+0.0185,R2=0.99208,线性范围在0～145 mg/L。

样品的测定:将供试液离心(6000 r/min,10 min),取上清液1 mL于10 mL比色管中,依相同方法测定其在765 nm下吸光度,根据标准曲线计算总多酚含量(以没食子酸计)[11-12]。

蓝莓果渣中总多酚含量(mg/g)=(提取液中总多酚含量(mg/mL)×提取液体积(mL))/蓝莓果渣重量(g)

1.2.9 抗氧化性实验

1.2.9.1 总还原力的测定 在10 mL离心管中分别加入0.2 mol/L,pH6.6的磷酸缓冲溶液2.5 mL和待测试液1 mL,加入2.5 mL,1%的铁氰化钾,混合均匀后于50 ℃反应20 min。取出后加入2.5 mL,10%三氯乙酸终止反应,5000 r/min离心10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL FeCl3,混合后静置10 min,稀释至适当浓度,在700 nm处检测吸光值,VC作为阳性对照[13]。

1.2.9.2 羟自由基(·OH)清除能力的测定 反应体系共4 mL包括:1.0 mL H2O2(8.8 mmol/L),1.0 mL FeSO4溶液(0.9 mmol/L),1.0 mL水杨酸(9 mmol/L),1.0 mL样品溶液,H2O2最后加入以启动反应,反应体系在37 ℃水浴中保温60 min,于510 nm处检测吸光度,并计算·OH清除率,并使用同样浓度的VC(抗坏血酸)作同样处理为阳性对照,计算公式如下[14]:

式中，A1:1 mL样品+1 mLFeSO4+1 mL水杨酸-乙醇+1 mLH2O2在510 nm的吸光度;A2:1 mL样品+1 mLFeSO4+1 mL水杨酸-乙醇+1 mL H2O在510 nm的吸光度;A3:1 mL蒸馏水+1 mLFeSO4+1 mL水杨酸-乙醇+1 mLH2O2在510 nm的吸光度。

样品活性测定:向10 mL比色管中加入4.5 mL pH8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液,2.2 mL蒸馏水,充分混匀后于25 ℃恒温水浴20 min,取出后立即加入花色苷提取液2 mL,再加入在25 ℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL,(使用10 mmol/L HCl配制,空白管使用10 mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液)。迅速摇匀后加入比色皿,于325 nm每隔10 s测一次吸光度,直至反应开始后5 min,计算线性范围内每分钟吸光度的增加率。使用抗坏血酸作为阳性对照,计算公式如下[15]:

式中，k0:邻苯三酚自氧化速率;k1:加入花色苷后邻苯三酚自氧化速率。

1.3 数据处理

实验数据以平均值±标准差表示,采用Origin 8.5进行绘图,采用Minitab 15软件进行Plackett-Berman试验设计,采用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Benhnken中心复合响应面设计及方差分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Berman实验设计

影响蓝莓干果渣提取液中花色苷含量的因素有乙醇pH、乙醇浓度、液料比、超声功率、提取时间等。为对这5个因素进行全面考察,选用N=11的Plackett-Berman设计,设计及结果见表3。运用Minitab软件分别计算各因素的效应,并对各因素效应进行t检验,选择置信度大于95%的因素作为显著因素作进一步考察。

表3 Plackett-Berman设计结果Table 3 Design result of Plackett-Berman

由表4得出,对花色苷含量有极显著影响的因素为液料比(p<0.01),对花色苷含量有显著影响的为乙醇pH和乙醇浓度(p<0.05),根据T值可知,液料比和乙醇pH对花色苷提取含量呈负效应,即在各自水平范围内,液料比与pH与花色苷含量呈负相关,而乙醇浓度对花色苷提取呈正效应,在其水平范围内与花色苷含量呈正相关。

表4 Plackett-Berman设计的各因素的系数的估计和显著性评价Table 4 Coefficient estimation and significance evaluation of the factors of Plackett-Berman

2.2 最陡爬坡(Steepest Ascent)试验

最陡爬坡实验设计及结果见表5。

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table 5 The design and result of the steepest climbing test

由表5得出,提取液中花色苷含量最大值出现在第3次实验附近,故以序号3的实验条件为响应面实验因素水平的中心点。

2.3 响应面设计确定显著因素的最优水平

运用Design Expert软件程序,根据Box-Benhnken法设计原理,设计3因素3水平的响应面实验,其设计及结果见表6。

表6 响应面中心组合设计及结果Table 6 Design and results of response surface center combination

利用Design Expert 8.0.6进行多元回归拟合,得到花色苷含量对实验因素的二次多项回归方程:

表7 方差分析表Table 7 Variance analysis table

通过响应面及等高线图可以直观的看到3个变量(液料比、乙醇浓度、乙醇pH)对花色苷含量的影响及3个变量之间的交互作用。图1a中,等高线接近圆形,故液料比和乙醇浓度交互作用不明显,由等高线图确定液料比的最佳水平范围为25～35 mL/g,乙醇浓度最佳水平范围为60%～70%。图1b中,等高线呈椭圆形,故液料比和乙醇pH交互作用明显,由等高线图确定液料比的最佳水平范围为25～35 mL/g,乙醇pH最佳水平范围为2～3.5。图1c中,等高线呈椭圆形,故乙醇浓度和乙醇pH交互作用明显,由等高线图确定乙醇浓度的最佳水平范围为55%～70%,乙醇pH最佳水平范围为2～3.5。对回归方程求解,得到当液料比30.5 mL/g,乙醇浓度为63.3%,乙醇pH为2.61时,提取液中花色苷含量由回归方程得到最大值为:500.91 mg/100 g。

图1 各因素对花色苷含量的影响的响应面图Fig.1 Response surface plot and its contour plot showing the effect of three factors on anthocyanin content

2.4 验证试验

蓝莓干果渣超声辅助提取最佳提取工艺参数为:液料比30.5 mL/g,乙醇浓度为63.3%,乙醇pH为2.61,超声功率为500 W,提取时间为20 min。考虑到试验的实操性,将最佳提取工艺条件修正为:液料比31 mL/g,乙醇浓度为63%,乙醇pH为2.6,超声功率为500 W,提取时间为20 min,在此条件下对蓝莓干果渣进行提取,平行进行3次试验,验证试验测得花色苷含量为(498.84±1.84) mg/100 g,平均值与预测值的绝对百分比偏差为2.08%,结果表明,经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合,证明用响应面法可以有效的优化蓝莓干果渣花色苷的提取工艺。

2.5 不同原料预处理和不同工艺提取液中总多酚和花色苷含量测定

A、B、C、D 4种提取液中总多酚和花色苷含量见图2,由图2可知,采用超声提取工艺,以蓝莓干果渣为原料的提取液(A)中总多酚含量和花色苷含量分别为9.21 mg/g和429.83 mg/100 mg,以蓝莓湿果渣为原料的提取液(B)的总多酚含量和花色苷含量分别为3.85 mg/g和204.78 mg/100 mg;采用搅拌浸提(无超声辅助)工艺,以蓝莓干果渣为原料的提取液(C)的总多酚含量和花色苷含量分别为6.91 mg/g和383.69 mg/100 mg,以蓝莓湿果渣为原料的提取液(D)的总多酚含量和花色苷含量分别为3.17 mg/g和198.88 mg/100 mg。相同工艺条件下,以蓝莓干果渣为提取原料的提取液比以蓝莓湿果渣为提取原料的提取液总多酚和花色苷含量高,分析是由于蓝莓干果渣经过粉碎、过筛,包裹在组织内的花色苷和总多酚类物质得到有效的释放,而蓝莓湿果渣颗粒较大,包裹在其中的花色苷和总多酚类物质没有有效浸提出来所致。相同原料,采用超声工艺的提取液比采用搅拌浸提(无超声)工艺的提取液中的总多酚和花色苷含量高,分析是由于超声波通过其机械效应、空化效应和热效应提高花色苷的溶出速率,机械效应可使乙醇产生振动,强化乙醇和花色苷的扩散、传播,还可以给予乙醇和花色苷以不同的加速度,空化效应可以起到破碎果渣细胞壁的作用,因而可以使总多酚和花色苷有效释放[16]。

图2 预处理方式和提取工艺对提取液中花色苷和总多酚含量的影响Fig.2 Effects of different pretreatment methods and extraction processes on anthocyanin and total polyphenols content in extract

2.6 抗氧化活性试验结果

2.6.1 总还原力 A、B、C、D 4种提取液的总还原力测定结果见图3,由图3可知,湿果渣为原料的提取液的总还原力更接近VC的总还原力。采用超声辅助提取工艺,以蓝莓干果渣为原料的提取液(A)的OD值较以蓝莓湿果渣为原料的提取液(B)的还原力OD值低;采用无超声辅助提取工艺,以蓝莓干果渣为原料的提取液(C)的还原力OD值较以蓝莓湿果渣为原料的提取液(D)的还原力OD值低,由此可见,在相同工艺条件下,以蓝莓湿果渣为提取原料的提取液比以蓝莓干果渣为提取原料的提取液的总还原力高,分析可能是干燥对果渣中抗氧化活性物质有破坏。相同原料,采用超声提取工艺较无超声辅助提取工艺提取液还原力高,因为超声波可有效促进果渣中的抗氧化活性物质的溶出。

图3 预处理方式和提取工艺对提取液抗氧化活性的影响Fig.3 Effects of different pretreatment methods and extraction processes on the antioxidant activity of the extract

2.6.2 ·OH清除率测定结果 A、B、C、D 4种提取液的·OH清除率见图4,由图可知,4种提取液的·OH清除能力约为VC的·OH清除能力的25%～40%,相同原料,采用超声辅助提取工艺较无超声辅助提取工艺所提取的提取液的·OH清除率高,分析是因为超声波可使果渣高效释放具有·OH清除率的物质;超声辅助提取工艺条件下,以蓝莓湿果渣为原料的比以蓝莓干果渣为原料的提取液的·OH清除率高,而无超声辅助提取工艺条件下,以蓝莓干果渣和湿果渣为原料的提取液的·OH清除率差别不大,分析可能是由于蓝莓果渣中具有·OH清除能力的物质多为热敏性物质,蓝莓湿果渣并未经过干燥处理,较大程度的保持了清除·OH的物质的活性,因而表现出更好的·OH清除能力。

图4 预处理方式和提取工艺对提取液羟自由基清除率的影响Fig.4 Effects of different pretreatment methods and extraction processes on the hydroxyl radical scavenging rate of the extract

图5 预处理方式和提取工艺对提取液清除率的影响Fig.5 Effects of different pretreatment methods and extraction processes on the scavenging rate of the extract

3 结论

通过响应面实验设计,得到蓝莓干果渣提取的最佳工艺为:液料比31 mL/g,乙醇浓度63%,pH为2.6,超声功率为500 W,提取时间为20 min,在此条件下蓝莓干果渣提取液中花色苷含量为498.84 mg/100 g。