响应面法优化热回流提取樟树叶中木脂素工艺

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(1.湖南省产商品质量监督检验研究院,湖南长沙 410004; 2.稻谷及副产物深加工国家工程实验室,湖南长沙 410004)

樟树(Cinnamomumcamphora)是樟科(Lauraceae)樟属(Cinnamomum)常绿性乔木,属药用植物,广泛分布于我国长江以南、西南各省以及台湾南部。樟树根茎发达、生长快,材质优良,具有“江南宝树”之称[1]。目前的研究表明,樟树含有的化学成分主要包括挥发性油[2]、蛋白核糖体[3]、黄酮类[4]、木脂素[5]、有机酸和甾醇等[6]。大量研究发现樟树的根、茎、叶、果实、籽均具有一定的生物活性,主要表现在抑菌、防腐保鲜、驱虫、抗氧化、消炎、细胞毒活性等方面[7]。

木脂素作为存在于植物中的一类由两分子苯丙素衍生物聚合而成的天然化合物,广泛分布于植物的根、茎、叶、花、种子等部位,多数呈游离状态,少数与糖结合成苷[8]。具有多种生物活性,如保护肝脏、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌等功效[9-10]。木脂素除了与多糖类物质形成极性较强的糖苷外,还易与植物体内其他物质结合,如多酚、黄酮类化合物以及叶绿素,使得木脂素很难与其他物质分离开来,从而增加了木脂素的提取难度[11]。另外,由于木脂素具有难溶于水,能溶于氯仿、乙酸乙酯、乙醚、乙醇和丙酮等亲脂性有机溶剂的理化特性,因此,对木脂素进行提取时，需要考虑合适的溶剂及提取方法。近年来,有关木脂素提取方法主要有热回流提取[12]、微波提取[13]、闪式提取[14]、离子液体超声提取[15]、超临界CO2提取等[16]。微波提取、离子液体超声提取以及超临界CO2提取等现代提取手段，虽然节省时间,但是装置复杂、设备昂贵。而热回流提取作为传统提取方法,虽然提取时间较长,但是操作简单、节约成本、低耗环保,尤其在药材中有效成分提取方面被广泛应用。此外,该方法可以减少木脂素类物质在提取过程中的损失。

目前,国内外对樟树叶中木脂素提取研究报道较少,因此,本研究采用热回流法考察乙醇浓度、料液比、回流次数、回流时间以及提取温度对樟树叶中木脂素提取量的影响,并通过响应面法优化最佳工艺条件,为樟树资源的进一步开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樟树叶(Cinnamomumcamphora(L.)Presl) 小叶樟,2016年5月摘自中南林业科技大学校区;五味子酯甲标准样品 色谱纯(纯度≥98%),上海源叶生物技术有限公司;变色酸 分析纯,天津市新精细化工开发中心;浓硫酸 分析纯,国药集团;无水乙醇 分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

JE602型精密电子天平 上海浦春计量仪器有限公司;Hei-VAP Precision型旋转蒸发仪德国Heidolph公司;HWS26型恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司;UV-1800型紫外分光光度计 日本岛津公司;101-2AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司;DZF-6050型真空干燥箱 上海博讯实业有限公司;SHZ-Ⅲ型循环水真空泵 郑州长城科工贸有限公司;KQ-300DB型数控超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 樟树叶中木脂素提取的工艺流程 樟树叶清洗、晾干→105 ℃烘箱内杀青30 min、再将烘箱调成至70 ℃至樟树叶烘干→粉碎过60目筛→乙醇热回流提取3次→真空抽滤合并滤液→浓缩→干燥(60 ℃，0.06 MPa真空干燥箱烘干至恒重)→乙醇溶解得木脂素待测液。

1.2.2 单因素实验 准确称取樟树叶粉5.0 g,置于圆底烧瓶内,考察乙醇浓度、料液比、回流时间、回流次数、提取温度对木脂素提取量的影响。

1.2.2.1 乙醇浓度对木脂素提取量影响 以料液比1∶16 g/mL、回流3 h、提取3次、60 ℃提取温度为固定条件,考察浓度为55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液对木脂素提取量的影响。

1.2.2.2 料液比对木脂素提取量影响 以85%乙醇、回流3 h、提取3次、60 ℃提取温度为固定条件,考察不同料液比1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20 g/mL对木脂素提取量的影响。

1.2.2.3 回流时间对木脂素提取量影响 以85%乙醇、料液比1∶12 g/mL、提取3次、60 ℃提取温度为固定条件,考察回流提取1、2、3、4、5 h后对木脂素提取量的影响。

1.2.2.4 回流次数对木脂素提取量影响 以85%乙醇浓度、料液比1∶12 g/mL、回流3 h、60 ℃提取温度为固定条件,考察回流提取1、2、3、4次后对木脂素提取量影响。

1.2.2.5 提取温度对木脂素提取量影响 以85%乙醇浓度、料液比1∶12 g/mL、回流3次、回流3 h为固定条件,考察提取温度为50、60、70、80、90 ℃对木脂素提取量影响。

1.2.3 响应面试验 根据单因素实验结果,选择对木脂素提取量影响较大的4个因素,即乙醇浓度、回流次数、提取温度以及料液比进一步考察。确定试验因素及水平之后，采用Box-Behnken试验设计,以乙醇浓度、回流次数、提取温度、料液比为影响因子,樟树叶中木脂素提取量为响应值,研究响应面法优化樟树叶中木脂素热回流提取工艺[18],各因素及水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.4 紫外可见分光光度法测定木脂素含量 标准曲线绘制:参考文献[17]并做修改,准确称取五味子酯甲对照品4.0 mg,用无水乙醇溶解并定容至10 mL,配制成0.4 mg/mL的储备液,分别吸取此溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL储备液于5 mL刻度试管中,水浴挥干乙醇,分别精密地加入10%变色酸水溶液0.5 mL、浓硫酸3 mL、蒸馏水1.5 mL,摇匀后在沸水浴中加热30 min,迅速冷却,用蒸馏水准确定容5 mL,使五味子酯甲的最终浓度为0、0.016、0.032、0.048、0.064、0.08、0.096 mg/mL,在570 nm处检测其吸光度,测定3次,以五味子酯甲的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。得浓度(mg/mL)与吸光度(A)的关系曲线,回归方程为:y=11.3275x+0.02277,相关系数R2=0.9995。

木脂素提取量按式(1)计算:

式(1)

式中:p-木脂素提取量,mg/g;c-样品中木脂素浓度,mg/mL;v-样品体积,mL;m-樟树叶质量,g。

1.3 数据处理

每组实验进行3次重复,采用origin 8.0对单因素实验结果进行作图,响应面优化试验中采用Design-Expert 8.0软件进行数据统计分析以及作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对樟叶木脂素提取量的影响 由图1可以看出,当乙醇浓度在55%～85%,随着乙醇浓度的增加,木脂素的提取量逐渐增加;而当浓度大于85%时,木脂素提取量逐渐减少,原因可能是水的极性较强,提取溶剂中水的含量影响该体系的极性,当溶剂乙醇浓度越高时水的含量会越低,溶剂的极性减弱,而木脂素属于弱极性分子,根据相似相溶原理,极性相近的有机物与有机溶剂更容易互溶,所以乙醇浓度在55%～85%范围内,木脂素提取量会随乙醇浓度增加而升高。当乙醇浓度达到85%时,此时溶剂极性与木脂素的极性最接近,木脂素提取量最高。但是当继续增加乙醇浓度时，木脂素提取量下降，有可能是溶剂的极性发生改变，不利于木脂素分子提取,另外,也有可能樟叶中其他物质的溶出阻碍了木脂素分子的溶出[19]。因此,选择乙醇浓度85%左右较合理。

图1 乙醇浓度对木脂素提取量影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction content of lignans

2.1.2 料液比对樟叶木脂素提取量的影响 由图2可知,随着料液比增加,樟树叶中木脂素提取量逐渐升高,当料液比为1∶12 g/mL时,木脂素提取量达到最大，继续增加料液比，提取量增加趋势不明显,基本稳定不变。一般来说,提取溶剂用量越大,分子溶出量越多。但当提取溶剂用量增加到一定程度,该溶剂已将木脂素分子基本溶出,故木脂素提取量趋于稳定。考虑到实际生产中需要节约资源降低成本,因此,选择料液比为1∶12 g/mL左右进行提取樟叶中木脂素。

图2 料液比对木脂素提取量影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction content of lignans

2.1.3 回流时间对樟叶木脂素提取量的影响 由图3可知,回流提取3 h,木脂素提取量最高为35.67 mg/g,回流时间小于3 h,木脂素提取量随时间增加呈现明显上升趋势,回流时间大于3 h,木脂素提取量随回流时间增加略有下降。一般来说,回流时间越长越利于木脂素的提取。但是,回流时间太长,木脂素提取量下降,可能是因为回流时间太久，使得木脂素分子结构受到温度影响发生变化，从而导致木脂素得率降低。因此,回流时间太久不利于木脂素的提取,故选择回流时间为3 h。

图3 提取时间对木脂素提取量影响Fig.3 Effect of time on extraction content of lignans

2.1.4 回流次数对樟叶木脂素提取量的影响 由图4可知,随回流次数增加,木脂素提取量逐渐上升,当回流次数大于3次时,木脂素提取量略有上升,但基本趋于稳定。一般情况下,木脂素提取量随提取次数增加而上升,但是当提取超过一定次数时,木脂素浸出将达到平衡阶段,木脂素提取量基本稳定不变。因此,选择提取2～4次之间较合适。

图4 提取次数对木脂素提取量影响Fig.4 Effect of times on extraction content of lignans

2.1.5 温度对樟叶木脂素提取量的影响 由图5可知,温度小于70 ℃时,随提取温度升高,木脂素提取量不断增加,温度达到70 ℃ 时,木脂素提取量达到最高值即42.95 mg/g。但是,当温度高于70 ℃时,木脂素提取量呈下降趋势。原因是温度升高可加快分子运动速度,同时,高温可以引起细胞膜结构发生变化导致其渗透、扩散、溶解速度加快。因此,随提取温度的升高樟树叶中木脂素类化合物的含量升高;但是,由于乙醇的沸点为78.3 ℃,温度过高可能引起乙醇挥发,水的含量相对增加,溶剂的极性也会增加,不利于木脂素的提取,高温也会引起木脂素类化合物结构被破坏导致其提取量降低。因此,选择65～75 ℃最为合适。

图5 提取温度对木脂素提取量影响Fig.5 Effect of temperature on extraction content of lignans

2.2 响应面优化分析

2.2.1 响应面实验结果 根据Box-Behnken Design的中心组合设计原理,综合考虑单因素实验的结果,采用4因素3水平的响应面分析方法,响应面优化分析方案及结果见表2。

表2 响应面试验方案与结果Table 2 Experimengtal design and responses values for response surface analysis

利用软件Design Expert 8.0,以樟树叶木脂素提取量为响应值进行分析,经回归拟合后得出,各影响因子对响应值影响的多元二次响应面回归模型用方程(2)表示,回归分析见表3。

Y=44.27+1.53A-1.18B-0.13C-1.59D+1.29AB-0.43AC-2.96AD+1.07BC-0.62BD-2.31CD-3.09A2-4.37B2-4.68C2-3.14D2

式(2)

2.2.2 各因素交互作用响应面图分析 响应值与各因素构成的三维空间，在二维平面上的等高图可以直观地反映各因素对响应值的影响。等高线图趋于椭圆形,表明交互作用明显;趋于圆形,表面交互作用较弱[22]。此外,若响应面的坡度较陡峭,表明响应值受操作条件的变化而影响较大[23]。

由图6a～图6f可以看出,乙醇浓度与回流次数、料液比与乙醇浓度、提取温度与回流次数以及料液比与提取温度之间交互作用的等高线均呈扁平状,表明上述因素的交互作用均对木脂素提取量有显著或极显著影响(p<0.05或p<0.01),其他因素之间交互作用对木脂素提取量无显著性影响。从响应面的最高点可以看出,在所选的范围内存在最大值即等高线最小椭圆的中心点为响应面的极值,也就是响应值的最大值[23]。

图6 提取条件对樟树叶中木脂素提取量交互影响的曲面图及等高线Fig.6 Surface and contour plots mutual influence for the extraction conditions on the yield of lignans from Cinnamomum camphora

2.2.3 最佳工艺条件的确定及验证 通过Design Expert 8.0软件,结合回归模型与响应面图分析得出,樟树叶粉为5.0 g时,回流提取樟树叶中木脂素最优工艺条件:乙醇浓度87.42%、回流3次、提取温度70.45 ℃、料液比1∶10.98 g/mL,此条件下木脂素提取量预测值为44.27 mg/g。考虑到实验操作的方便性,将响应面分析得到的最优工艺条件调整为:乙醇浓度87%、回流3次、提取温度70 ℃、料液比1∶11 g/mL,此条件下进行3次重复试验后,木脂素平均提取量为(43.39±4.91) mg/g,与预测值的相对误差较小,表明预测值与实验值具有良好的一致性,进一步说明该回归模型的准确性和可靠性,具有一定应用价值。

3 结论

在单因素试验基础上,采用Box-Behnken设计试验,以乙醇浓度、料液比、回流次数及提取温度为影响因子,樟树叶中木脂素提取量为响应值,进行响应面法优化樟树叶中木脂素的热回流提取工艺,得出最佳提取工艺条件为:乙醇浓度87%,料液比1∶11 g/mL,回流3次,提取温度70 ℃,此条件下木脂素的提取量为(43.39±4.91) mg/g。验证实验结果表明,实测值与理论预测值存在较好的一致性,此回归模型对于优化樟树叶中木脂素的热回流法提取工艺是合理的。