降解玉米赤霉烯酮菌株的鉴定及其发酵条件优化

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(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉 430068)

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)是一种真菌毒素，也是世界上污染最广泛的毒素[1],具有雌激素效应,是早期Stob等[2]从霉变的玉米中得到,其分子式为C18H22O5,化学名为6-(10-羟基-6-氧基-十一碳烯基)β-雷锁酸内酯,又称为F-2毒素[3]。ZEN对小米、玉米、燕麦等都有污染作用[4],对人和动物也存在着危害,尤其对猪更为敏感,可致使流产、死胎,子宫内膜纤维化以及生殖道体积增大[5-6],研究中也发现玉米赤霉烯酮能引起食道癌[7]。

降解ZEN方法有很多,在目前的方法中,物理法包括热处理、剔除、脱壳、吸附剂吸附等[8-10],化学法包括臭氧处理、双氧水处理等[11-12],但由于物理法和化学法成本较高,会破坏食品的营养价值，且在消除ZEN的过程中会带入一些不确定的物质,所以近几年使用生物法降解ZEN的越来越多。生物法降解玉米赤霉烯酮是指将一些真菌、细菌、霉菌如龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)[13]、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens,ZDS-1)[14]、黑曲霉(FS10)[15]等微生物作用于ZEN,并将ZEN转化为其他物质的方法。如Keller等[16]发现了酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)可将ZEN转化为α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL,53%)和β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL烯醇,8%)这两种衍生物,其中α-ZOL的雌激素毒性要远远低于ZEN。这种降解方法高效、无污染、无危害,不会降低食物的营养价值,特异性强,而微生物酶降解在市场上的需求量很大[17-19],因此生物法降解ZEN已成为现阶段研究的热点。

本文主要是对能降解玉米赤霉烯酮的菌株进行鉴定，并对其发酵上清液的发酵条件进行了单因素实验,得到ZEN降解的较优条件,为进一步探讨ZENL09降解ZEN的机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枯草芽孢杆菌ZENL09 4 ℃保藏,本实验室从土壤样品中筛选得到;ZEN标准品4 ℃保存,以色列Fermentek公司;甲醇、乙腈 色谱纯,美国Fisher Scientific公司;二氯甲烷 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;斜面培养基(g/L):蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20,琼脂20;种子培养基(g/L):蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20;发酵培养基(g/L):蛋白胨20,酵母粉10,葡萄糖20。

LC-20AD型高效液相色谱仪 日本Shimadzu公司;WH-2型漩涡震荡仪 上海沪西分析仪器有限公司;PHS-25型pH计 上海雷磁公司;TGL-16C型台式离心机 上海安亭科学仪器厂制造;3K15型台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司;ZHWY-2102C型恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司;D2F-6090型真空干燥箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株的鉴定 将筛选得到的菌株(ZENL09)送往中国典型保藏物中心(CCTCC)进行鉴定,主要鉴定内容为:微生物菌株16S rRNA基因序列的测定与分析;微生物菌株的形态观察;微生物菌株的生理生化特性;微生物菌株的分类地位。

1.2.2 生长曲线的测定 将保藏的菌株在超净台中转接到斜面培养基上,在30 ℃恒温箱中培养24 h后再转接到种子培养基中作为种子液,在160 r/min、30 ℃下培养，每隔2 h取一次样,用灭菌的生理盐水作为对照,在600 nm的波长下测定其吸光度(OD)值,当样液浓度过高时采取适当的稀释处理。以OD值为纵坐标,培养时间为横坐标做菌株的生长曲线。

1.2.3 发酵时间对ZEN降解率的影响 在温度为30 ℃,转速160 r/min,装液量50 mL/250 mL,将种子液以5%的接种量接种于发酵培养基中,将发酵液分别培养12、24、36、48、60、72 h时,探究发酵时间对ZEN降解率的影响。

1.2.4 接种量对ZEN降解率的影响 在温度为30 ℃,转速160 r/min,装液量50 mL/250 mL,种子液接种量分别为1%、3%、5%、7%、9%、11%时,培养24 h,探究接种量对ZEN降解率的影响。

1.2.5 摇床转速对ZEN降解率的影响 在温度为30 ℃,摇床转速分别为140、160、180、200、220 r/min时,装液量50 mL/250 mL,将种子液以3%的接种量接种于发酵培养基中,培养24 h,探究摇床转速对ZEN降解率的影响。

1.2.6 装液量对ZEN降解率的影响 在温度为30 ℃,摇床转速200 r/min,装液量分别为25、50、75、100、125、150 mL/250 mL,将种子液以3%的接种量接种于发酵培养基中培养24 h,探究装液量对ZEN降解率的影响。

1.2.7 发酵温度对ZEN降解率的影响 当温度为27、30、33、36、39 ℃时,摇床转速200 r/min,装液量25 mL/250 mL,将种子液以3%的接种量接种于发酵培养基中培养24 h,探究发酵温度对ZEN降解率的影响。

1.2.8 ZEN降解率的测定 取上述发酵液50 mL,8000 r/min离心10 min,然后将上清液倒入干净的离心管中,调节上清液pH至7.5以下。取上清液950 μL倒入5 mL离心管中设置三组平行,向离心管中加入50 μL浓度为20 μg/mL的ZEN甲醇溶液,恒温37 ℃反应24 h。反应后三组平行分别加入1 mL的二氯甲烷进行萃取(反复萃取三次),若萃取过程中发现液体浑浊，则再加入1 mL的甲醇溶液进行震荡后完成萃取,将萃取后的液体真空干燥蒸发二氯甲烷。蒸发后用甲醇溶解残存的ZEN,溶解液用0.22 μm的有机系滤膜过滤。以灭菌的液体培养基添加50 μL的ZEN作为空白对照组,将ZEN标准品用甲醇稀释到浓度为1μg/mL作为对照组,参照国标GB/T5009.209-2016用高效液相色谱法测定玉米赤霉烯酮的降解率。ZEN降解率计算公式为:

高效液相色谱条件为:色谱柱:C18柱(250 mm×4.6 mm,4 μm);流动相:乙腈/水/甲醇=46/46/8(v/v/v);流速1.0 mL/min;柱温:室温;进样量:20 μL;波长:236 nm。

1.3 数据处理

每组实验做三组平行,采用SPSS Statistics WinWrap Basic Script软件分析数据的显著性,用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 菌株的鉴定

图1所示,ZENL09形态特征为:菌落表面粗糙不透明,微黄色带点红。椭圆到柱状,着色均匀,无荚膜,周生鞭毛,为革兰氏阳性菌。中国典型培养物保藏中心(CCTCC)测定该菌株的16S rRNA基因序列后，经BLAST验证发现，ZENL09与枯草芽孢杆菌的序列相似度很高达到99.51%。根据序列的比对结果构建进化树如图2所示,ZENL09与Bacillussubtilis在同一分支上其同源性很高。

图1 ZENL09形态学特征Fig.1 Morphological characteristics of ZENL09注:a.菌株ZENL09的平板菌落形态; 菌株ZENL09显微镜观察照片(1000×)。

图2 基于16S rRNA序列的ZENL09菌株系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of ZENL09 strain based on 16S rRNA sequence

由菌株ZENL09的生理生化特性分析可知,在酶活与碳源同化试验中,ZENL09可分解利用多种物质,也可在代谢过程中产生多种酶(见表1),在表2中可看出ZENL09可利用多种碳源产酸,这与枯草芽孢杆菌的的生理生化特性一样,因此结合各项检测结果最终鉴定ZENL09菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

表1 菌株ZENL09生理生化特性(酶活、碳源同化)Table 1 Physiological and biochemical characteristics of ZENL09(Enzyme activity,carbon source assimilation)

表2 菌株ZENL09生理生化特性-利用碳源产酸Table 2 Physiological and Biochemical Characteristics of ZENL09-acid production from carbon source

2.2 生长曲线的测定

由图3可以看出,ZENL09在0～6 h生长很缓慢,在6 h后进入对数期,菌体浓度逐渐增大,菌生长较快,种子培养基变得浓稠,在此阶段菌株生长的最好;24 h时菌体增长速率最高,此后24～30 h生长逐渐稳定,细菌的繁殖速度逐渐下降,有部分细菌开始死亡。所以选择24 h作为菌株ZENL09的生长时间即为种子液的培养时间。

图3 ZENL09在种子培养基中的生长曲线Fig.3 Growth curve of ZENL09 in seed medium

2.3 发酵时间对ZEN降解率的影响

由图4分析可知,在24 h时ZEN的降解率达到最高,而后随着发酵时间变长,ZEN的降解率反而降低。因此说明随着发酵时间的增长,菌体大量繁殖,降解ZEN的活性物质起初在增加，在48 h后,菌体繁殖越来越慢,死亡的菌数增多,导致作用于ZEN的活性物质逐渐减少,因此后期ZEN的降解率降低。由此可见,发酵时间对ZEN的降解率有一定影响,所以选择降解率最高的24 h作为发酵时间。

图4 发酵时间对ZEN降解率的影响Fig.4 Effect of fermentation time on ZEN degradation rate注:不同小写字母代表差异显著(p<0.05);图5～图8同。

2.4 接种量对ZEN降解率的影响

如图5所示,在接种量很少时,菌生长速度较慢,ZEN的降解率较低,随着接种量的增多,ZEN的降解率先增高后逐渐降低,在接种量为3%时，ZEN降解率达到最高为72.5%,但与接种量为5%时无显著性差异,当接种量高于5%时,ZEN的降解率逐渐降低,推测菌、体生长得速度比较快,可能快速过度到衰亡期[20],而使得只有部分存活的菌作用ZEN,从而导致ZEN降解率降低,因此选择3%为最适接种量。

图5 接种量对ZEN降解率的影响Fig.5 Effect of inoculum size on ZEN degradation rate

2.5 摇床转速对ZEN降解率的影响

由于枯草芽孢杆菌是一种好氧菌,适宜在氧量高的环境下生长[21]。如图6所示,随着摇床转速的增加,ZEN的降解率在逐渐增加,说明摇床转速越高,ZENL09菌的新陈代谢越快,能够快速转化为活性物质并作用于ZEN上，使得其降解率越高。但当转速为200和220 r/min时,ZEN降解率无明显差异,然而相比较而言,转速高时对于摇床的损耗是比较严重的,所以选择200 r/min作为摇床转速。

图6 摇床转速对ZEN降解率的影响Fig.6 Effect of shaker speed on ZEN degradation rate

2.6 装液量对ZEN降解率的影响

如图7所示,由于装液量越少,通气效果好,溶氧系数大,利于菌体生长,所以当装液量为25 mL/250 mL时，ZEN降解率最高,但与50 mL/250 mL无显著性差异,因此从工艺成本考虑，选择25 mL/250 mL为最适装液量。

图7 装液量对ZEN降解率的影响Fig.7 Effect of liquid loading on the degradation rate of ZEN

2.7 发酵温度对ZEN降解率的影响

随着发酵条件的优化,ZEN的降解率也越来越高,如图8所示,在改变温度的过程中,当发酵温度为33 ℃时,ZEN的降解率高达96%,因此在此温度下降解ZEN的物质活性达到最大,当温度继续增加,ZEN降解率降低,可能是由于此时降解ZEN的物质活性降低,故选择33 ℃为最适发酵温度。

图8 发酵温度对ZEN降解率的影响Fig.8 Effect of fermentation temperature on ZEN degradation rate

3 结论

从土壤中筛选出一株具有高效降解ZEN的菌株(ZENL09),通过16S rRNA序列分析、NCBI上的BLAST比对以及菌株形态观察、理化特性分析,中国典型培养物保藏中心(CCTCC)鉴定该菌株ZENL09为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。通过改变枯草芽孢杆菌的培养时间，确定种子液的最适生长时间为24 h,研究得到其发酵条件为:在温度为33 ℃,转速200 r/min,装液量25 mL/250 mL时,将种子液以3%的接种量接种于发酵培养基中培养24 h,ZEN的降解率达到了96%。在接下来的实验中,将进一步缩短ZEN与发酵上清液的反应时间,并探究ZENL09的发酵上清液降解ZEN的机制以及降解的可能产物。