杨树锈病病原菌的分子鉴定及防治措施

莫丁山

【摘要】青杨铸病是互助县杨树人工林和天然林的重大病害之一，在纯林或落叶松混交林中均普遍发生并造成严重的经济损失，该研究对互助县南门峡林场杨树锈病病原菌进行了分子鉴定，为明确其正真的病原菌种类并总结了防治措施。

【关键词】杨树 锈病 分子鉴定 防治技术

1 病害调查

2015-2017年，在互助县南门峡林场选取10块标准地，7～10月每隔1月调查一次青杨锈病发病率与病情指数。标准地的设置为每块标准地面积约为30×30m₂，每块标准地内随机选4～5行青杨，各行再每隔3株选取1株，随机摘取上、中、下三个部位青杨叶片，总调查30～50株，叶片总数不少于800片；对于散生的青杨，依据实际分布情况随机选取调查株。青杨锈病病害严重度分级参照曹支敏等的分级标准，见表1。

经调查发现，青杨锈病主要危害青杨苗木和新生叶片，导致未成熟芽早落，该病害于5-6月在叶背出现退绿斑点并产生夏孢子堆，并产生桔黄色小泡，破皮后散出黄粉堆，严重时黄粉布满整个叶背，9月，叶正面出现锈红色斑点，并逐渐变成棕色至褐色的冬孢子堆，叶子提前脱落，树木长势变弱易受其它病原物侵染。

2 病原菌分子鉴定

2.1 夏孢子DNA提取

取夏孢子DNA，用灭菌载玻片刮取新鲜夏孢子堆于灭菌研钵中研磨，置于1.5mL离心管内，具体加样步骤如下：①加20μl的Lysozyme溶液，混合，室温静置6min；②加30μl的EDTA Buffer，混合，室温静置5min；③加200μl的Solution A，振荡，65℃保温10min；④加400μl的Solution B，剧烈振荡15S；⑤加650μl的So-lution C，混合；12，000rpm離心1min，弃上层，将无色下层移人预先置于1.5ml离心管上的Filter Cup中，12，000rpm离心1min。⑥弃Filter Cup，在滤液中加入450μl的DB Buffer，混合均匀。将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。⑦将上述操作的混合液转移至Spin Column中，12，000rpm离心1min，弃滤液。⑧将500μl的Rinse A加入至Spin Column中，12，000rpm离心1min，弃滤液。将700μl的Rinse B加入至Spin Column中，12，000rpm离心1min，弃滤液。⑨将Spin Column安置于CollectionTube上，12，000rpm离心1min。⑩将Spin Column安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60μl的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1min。12，000rpm离心1min洗脱DNA。

2.2 PCR扩增及扩增产物电泳检测

扩增引物为：ITS1-F和ITS4-B GardesM、B runs T D。

反应体系为：2μL摸板DNA、36.5μL ddH2O、2μL MgCl2（25mm ol L-1）、5μL10×PCR Buffer，0.5μLdNTPS（10mm olL-1）、1μL⑩ITSI-F（10μm of L-1）、1μL ITS4-B（10μm of L-1）、4U Taq酶（生工）。

反应条件：61℃1′15″，93℃1min，55.3℃1′15″，72℃1′30″，30cycles，72℃ 10min，4℃保存。反应前将底物在95℃温育5min，然后迅速置-20℃保存。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并成像。

2.3 rDNA-ITS序列测序及同源性比对

以夏孢子的ITS1和ITS4区扩增产物进行全序列测定（金唯智生物科技（北京）有限公司），并将获得的DNA序列在NCBI上进行比对。将rDNA-ITS序列PCR产物进行测序，所得结果比对，结果显示与Melampsora larici-populina序列同源性为99%。rDNA-ITS序列长度为663bp。基于Nei's（1978）构建无偏遗传距离的系统树状图，系统树状图显示实验种与Melampsora larici-populina（DQ234698） ITS序列聚为一类，同源性为99.8%。明确该菌为落叶松杨栅锈菌（Melampsora larici-populina）。

3 防治技术

青杨林是一个生态经济系统，对杨树病害的防治不能孤立地、片面地进行，而应从杨树林生态系统的总体出发，以预防为主，有机地运用林业、生物、化学等综合防治措施，达到有效地控制病害的目的。

3.1 有效的预防措施

在有条件的地方增施一些磷（P）、钾（K）肥，控制氮（N）肥，提高林木抗病力，在田间管理上，应注意及时清除带病落叶，减少病菌的侵染来源。另外，由于夏孢子大多降落在离其发生处300米的范围内，青杨育苗区应选择远离发病区300米以外的安全地带，防止大面积青杨林的病菌孢子扩散传播到苗圃，减少苗木发病。

3.2 化学防治措施

防治杨树锈病应在早春用药，避免传播。早春时及时发现颜色鲜艳并存在畸形生长的芽，摘除病芽，并及时销毁，对防止夏孢子扩散侵染效果十分显著，可大大降低锈病发病率。也可以在早春阶段，采取摘除病芽和药剂防治相结合的防治手段，控制病害发生。对已发病的苗圃，可喷洒50%多菌灵800倍液，对已发生锈病的幼树和大树，在发病初期，可喷洒50%代森铵水剂100倍液、退菌特500～1000倍液、25%三唑酮可湿性粉剂1000倍液，或喷洒0.3～0.4度石硫合剂，有一定的效果。发生严重时，应在第一次用药后15～20天喷第二次，连喷2～3次。

3.3 选育抗性品种

目前也发现了一些与杨树抗病性相关的基因或分子标记，而采用分子标记定位抗性基因和构建抗病基因连锁遗传图谱技术，结合传统抗病选种育种方法，正成为杨树抗病育种先进模式。

参考文献：

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