参芪苡术汤通过Wnt/β-catenin通路调控胃癌细胞上皮-间质转化的实验研究

徐建林，陆为民

（1.南京中医药大学附属盐城市中医院，江苏 盐城 224000；2.南京中医药大学附属医院，南京 210029）

胃癌的发病机制尚不完全明确，目前主要认为与遗传因素、环境因素、饮食因素、胃部微生态等因素有关。近年来利用分子生物学手段研究胃癌的发病机制和有效药物对胃癌的作用机制，是当前研究的热点。有研究[1]认为中医学可以通过健脾化痰散结法来逆转细胞上皮间质转化达到治疗胃癌的目的。参芪苡术汤是国医大师徐景藩教授治疗胃癌的基本方，临床疗效明显。本实验研究围绕Wnt/β-catenin信号通路，探讨参芪苡术汤对SGC-7901细胞侵袭、上皮间质转化（EMT）以及Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Vimentin、p-Gsk3β和β-catenin表达的影响，以进一步阐明参芪苡术汤治疗胃癌的科学机制。

1 材料与方法

1.1 动物血清制备 Wister大鼠，按大鼠每天剂量为1.8 g/100 g灌胃给参芪苡术汤，连续给药5 d，制备空白血清和含药血清，细胞培养将空白血清稀释10倍，含药血清分别稀释5、10、15倍3个浓度进行细胞实验，则每天的对应剂量分别为3.6 g/100 g、1.8 g/100 g、0.9 g/100 g。

1.2 细胞来源 实验细胞人胃癌细胞SGC-7901，盐城市中医院中心实验室细胞库自己保存。实验所需仪器、试剂与耗材由盐城市中医院中心实验室及江苏医药职业技术学院实验室提供。

1.3 细胞培养 SGC-7901细胞采用完全培养基（90%DMEM+10%胎牛血清）于37℃、5%CO2、20%O2的细胞培养箱中，取指数生长期的SGC-7901细胞（100 mm培养皿），用吸虑泵吸去培养液。用PBS洗涤，加入0.25%胰蛋白酶，在37 ℃培养箱中消化1 min，后转入10 mL的无菌离心管中离心，弃上清，加入冻存液，轻轻吹打使细胞重悬，然后冻存。

1.4 Transwell实验 在4 ℃下解冻Matrigel，过夜；在冷冻细胞培养基（RPMI1640）中（不含有血清）将Matrigel稀释至5 mg/mL；把稀释的基质胶100 µL放入到24孔transwell的上室；37 ℃下孵育transwell 5 h，胶凝；用含1% FBS的培养基（RPMI1640）洗涤人胃癌细胞株SGC-7901细胞，连续3次；重悬人胃癌细胞株SGC-7901细胞到含有1%FBS的培养基中，密度106个/mL；用血清游离培养基洗涤凝胶基质胶；将100 µL人胃癌细胞株SGC-7901细胞悬浮液缓缓置于基质胶上；把600 µL培养基（含有5 µg/mL纤连蛋白）填充到下腔室作为粘附性底物；于37 ℃下孵育24 h；从24孔板移除transwell，并染色；刮掉transwell顶部的未浸润细胞；在光学显微镜下随机选取5个视野，观察并计数侵袭的细胞数。

1.5 Western Blot实验 用不同浓度参芪苡术汤大鼠含药血清（每天0.9 g/100 g、每天1.8 g/100 g、每天3.6 g/100 g）处理细胞24 h，提取各组细胞总蛋白。用参芪苡术汤大鼠含药血清处理 LICL处理过的24 h的人胃癌细胞SGC-7901 24 h，提取细胞总蛋白。BCA检测试剂盒测定各组细胞的蛋白浓度。分别取总蛋白15 μg上样，经 12%分离胶及5%浓缩胶SDSPAGE 凝胶电泳后湿转法转 PVDF 膜。加入特异性一抗4 ℃过夜与二抗室温孵育2 h后，暗室中曝光和显影，测定蛋白条带的光密度值，以表示蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学方法 使用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度参芪苡术汤（SQYZ）大鼠含药血清对SGC-7901细胞形态学的影响 实验分组分别为NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤大鼠含药血清（低）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤大鼠含药血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤大鼠含药血清（高）。各组胃癌SGC-7901细胞培养24 h后收集细胞，电镜下观察细胞形态。参芪苡术汤大鼠含药血清按每天0.9 g/100 g、每天1.8 g/100 g、每天3.6 g/100 g顺序排列记为参芪苡术汤大鼠含药血清（低）、参芪苡术汤大鼠含药血清（中）、参芪苡术汤大鼠含药血清（高）剂量组，下同。

结果显示，LiCl刺激24 h后，可显著改变SGC-7901的形态，由上皮型向间质型转化，低剂量参芪苡术汤含药血清并不能逆转细胞上皮间质转化趋势，随着含药血清剂量增加，在中剂量和高剂量逐渐出现上皮间质转化被逆转现象，从图可以看出，中剂量和高剂量参芪苡术汤大鼠含药血清处理后，上皮型细胞数目（所占比例）逐渐增多。见图1。

图1 不同浓度参芪苡术汤（SQYZ）大鼠含药血清对SGC-7901细胞形态学的影响

2.2 不同浓度参芪苡术汤（SQYZ）大鼠含药血清对SGC-7901细胞侵袭的影响 实验分组分别为NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤大鼠含药血清（低）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤大鼠含药血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤大鼠含药血清（高）。各组胃癌SGC-7901细胞培养24 h后收集细胞，采用Transwell实验方法观察并计数各组胃癌SGC-7901细胞侵袭细胞数目。

结果显示，LiCl刺激24 h后，可显著促进SGC-7901的侵袭，穿过Transwell孔的细胞显著增多，低剂量参芪苡术汤大鼠含药血清并不能逆转细胞侵袭趋势，随着含药血清剂量增加，在中剂量和高剂量逐渐出现侵袭被逆转现象，中剂量和高剂量参芪苡术汤大鼠含药血清处理后，穿过Transwell孔的细胞数目明显减少。见图2。穿过Transwell孔的细胞定量的统计。见图3。

2.3 不同浓度参芪苡术汤（SQYZ）大鼠含药血清对SGC-7901细胞Wnt信号通路、EMT关键蛋白表达的影响 实验分组分别为NaCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤含药血清（中）、LiCl（20 mmol/L）+参芪苡术汤含药血清（高）。各组胃癌SGC-7901细胞培养24 h后收集细胞，采用Western blot方法分别检测p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白的表达情况。

图2 不同浓度参芪苡术汤（SQYZ）大鼠含药血清对SGC-7901细胞侵袭影响

图3 穿过Transwell孔的细胞定量统计

结果显示，LiCl刺激4 h后，可激活SGC-7901的Wnt信号通路促进上皮间质转化，可使其关键蛋白p-Gsk3β、β-catenin和Vimentin表达上调，中剂量和高参芪苡术汤含药血清处理后，p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表达明显受到抑制，见图4。对p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表达半定量扫描的结果。见图5。

图4 不同浓度参芪苡术汤（SQYZ）大鼠含药血清对SGC-7901细胞Wnt信号通路、EMT关键蛋白表达的影响

图5 p-Gsk3β、β-catenin及Vimentin蛋白表达半定量结果

3 讨论

已知上皮-间质转化（EMT）有助于癌症进展和转移[2-5]。经历EMT的癌细胞可以获得侵袭能力并进入周围组织，导致转移的发生。在EMT的过程中，上皮细胞失去与它们的相邻组织的接触并获得间质性质，使得它们能够穿透基底膜得以转移性传播[6]。EMT的上皮细胞标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）表达下调，间叶细胞标志物波形蛋白（vimentin）表达上调。研究[7]表明肿瘤细胞具有EMT特征并且显著增强侵袭能力，具有降低E-钙粘蛋白水平和增高的波形蛋白，纤连蛋白，Twist和AKT2水平。转移可能在很大程度上取决于癌细胞获得EMT特征的能力[8-9]。研究[10]人员发现芍药苷通过在缺氧条件下抑制EMT来阻断乳腺癌细胞的迁移和侵袭。Cui[11]推测天冬酰胺酰内肽酶可以通过AKT和MAPK信号通路通过EMT促进胃癌的侵袭和转移。此外，EMT的作用不仅包括增加迁移，侵袭能力和转移潜力，而且还包括获得化学耐药性[12]。所以，EMT抑制剂的发展可能为预防和治疗癌症提供机会。

研究[13]表明，Wnt/β-catenin信号通路在诱导胃癌EMT和侵袭转移能力增强中发挥关键作用。研究[14]观察到Wnt-1和β-catenin在晚期胃癌患者的细胞中过表达。Wnt /β-catenin信号通路在癌症中的作用通过Wnt稳定β-catenin的能力达成，β-catenin是参与细胞与细胞黏附和信号转导两个独立过程的多功能蛋白[15]。在EMT过程中，β-catenin从E-钙粘蛋白复合物释放到细胞质中，在细胞质中与其它蛋白质相互作用，提高β-catenin传导增加了EMT发生的可能性[16]。此外，β-catenin可以转移到细胞核中，驱动重要的细胞周期蛋白、癌基因和蛋白酶的表达，包括c-myc、MMP-7[17]和细胞周期蛋白D1[18]。Zhang等[19]报道，质子泵抑制剂泮托拉唑可以通过抑制过度活化的Wnt/β-catenin信号传导通路抑制胃癌细胞的化疗耐药和EMT，不仅说明经典Wnt/β-catenin信号通路介导激活EMT和胃上皮细胞恶变，还证明了质子泵抑制剂可以抑制胃癌的侵袭。

LiCl是当前最常用的Wnt/β-catenin信号传导通路激活剂[20]。本研究发现LiCl刺激胃癌SGC-7901细胞后可以使Wnt/β-catenin信号传导通路关键蛋白p-Gsk3β、β-catenin和EMT关键标志物Vimentin表达上调，并在光学显微镜下观测到明显的上皮间质转化形态学变化，以及胃癌SGC-7901细胞的侵袭能力增强，参芪苡术汤大鼠含药血清一定浓度下可以抑制LiCl刺激胃癌SGC-7901细胞后带来的这些变化，我们推测参芪苡术汤可能抑制胃癌发生发展过程中Wnt/β-catenin信号传导通路的过度激活，并通过调控Wnt/β-catenin信号传导通路抑制胃癌发生发展侵袭转移过程中的EMT，发挥抗肿瘤效应。