微囊化包被技术在饲用益生菌上应用的研究进展

唐仁龙 ，王 羽中，汪海峰 ,

（1.浙江农林大学动物科技学院，浙江杭州311300；2.浙江大学动物科学学院，浙江杭州310058）

近年来，畜牧养殖中抗生素残留与耐药性问题形势严峻，抗生素替代物的研发是当前热点，饲用益生菌为替代抗生素的一种有效手段。益生菌定义为具有活性的微生物，只有在摄入活菌数达到一定数量时，才能给寄主带来多元的益生效果[1]。农业部发布的《饲料添加剂目录（2013）》可应用于养殖动物的饲用微生物有30余种，包括各类芽孢杆菌属、双歧杆菌属、肠球菌属、乳杆菌属等[2]。 随着对益生菌研究的深入，越来越多的益生菌功效已经被人们所探知，益生菌在促进人或动物健康[3]与疾病治疗[4]方面都被证实了具有一定的益生效果，因此，在食品行业和医学领域中益生菌应用也成为了热点。

微囊化技术是利用一些可以成膜的物质，将芯材（固体、液体和气体）包埋在微小封闭的微胶囊内的技术，微胶囊能保护芯材不受环境中各种严酷因子的压迫[5]，增加芯材的保存时间，必要时对芯材进行可控的释放。目前，微囊化技术已经在医学、畜牧、食品、印染等各领域广泛应用。为了更好地将益生菌应用到各个领域，需要在生产和应用过程中对益生菌进行充分的保护。本文综述了不同微囊化材料和微囊化技术、微囊化包被改进益生菌对各种不利环境的抗逆性作用，为提高饲用益生菌的抗逆性提供一定借鉴和启示。

1 益生菌抗逆特性及其改进技术

饲用益生菌在保存及使用时，往往会受到来自外界环境与动物体内各种不利条件的影响，包括氧气、高温、胃酸、胆汁盐、抗生素和其他细菌等，大多数益生菌对这些不利因素的抗逆性较差，导致自身活性降低甚至死亡。氧气是影响益生菌储存能力的一大关键因素，特别是厌氧型益生菌，这类益生菌在有氧条件下生长缓慢并死亡[6]。以口服形式进入活体肠道内的益生菌必须经过胃肠环境，胃酸、胆汁、胃蛋白酶等导致许多益生菌不能活着到达小肠后端[7]，多种乳酸菌在模拟胃液的处理过程中存活能力不断降低，存活率不足几万甚至几亿分之一[8]。

为了提高益生菌在不利环境中的存活能力，对其进行保护等技术改进：①微囊化法，包裹或固定益生菌，起到保护作用；②抗性诱导法[9]，通过条件刺激产生抗性菌株；③添加保护剂[10]，在益生菌中添加保护剂提高其抗逆性。

2 益生菌微囊化的壁材

针对不同益生菌的性状选择合适的壁材至关重要。目前，大多数益生菌选择的微囊化壁材主要是蛋白质、多糖类或淀粉类物质，不同类型的微胶囊材料的理化性质不同，制作的微胶囊的性质也有所区别。

2.1 蛋白类 蛋白质由于其营养价值和良好的乳化性能而常被作为微囊化壁材，常用的蛋白质壁材有乳清蛋白、酪蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白、明胶等。在益生菌微囊化的应用中，蛋白制作的益生菌微胶囊具有良好的稳定性，能够极好地控制益生菌在肠道内的释放[11]。乳清蛋白溶性极佳，乳化性优良，但是热敏感性强；酪蛋白表面活性较高，对低pH环境具有较强的缓冲能力。已有一些技术通过乳清蛋白和酪蛋白来包囊几种乳酸菌和双歧杆菌，提高它们的抗逆性[12]。明胶具有良好的水溶性、乳化性和降解性[13]，经常与海藻酸钠相结合用于益生菌的包被[14-15]。

2.2 多糖类 益生菌微囊化的多糖类壁材的种类很多，可分为碳水化合物类、植物胶类和细菌多糖类等，由于大多数多糖具有良好的生物相容性、合适的粘稠度与一定的溶解性，并能在生物中降解，所以许多研究者选择用多糖作为主要的微囊化材料。常见的多糖类微囊化壁材及其特点见表1。

2.3 改性淀粉 近年来，以淀粉为基质的微囊化产品在食品行业中日益增加。淀粉具有安全无毒、材料成本低、不致敏且味道平淡的特点。淀粉常常通过物理法、化学法和酶改法变成改性淀粉，以达到微囊化材料所需的性质[16]。微孔淀粉吸附能力强，增加微孔淀粉浓度可以提高细胞的存活率，微孔淀粉在模拟胃肠道内能保护益生菌[17]。Cortés等[18]提出，改性过的苋菜淀粉和玉米淀粉都能提高储存期益生菌的存活能力，其中琥珀酰化淀粉使益生菌对模拟胃肠道环境产生更强的抗逆性。双歧杆菌和乳酸杆菌也都能以辛烯基琥珀酸酐改性淀粉（OSA淀粉）作材料通过喷雾干燥法制成微胶囊。与海藻酸钠作为壁材相比，聚丙烯酸钠改性海藻酸钠显著提高了微胶囊中乳酸菌的抗逆性[19]。

2.4 纳米材料 “纳米技术”在近20年得到广泛应用，纳米材料的大小通常在1～100 nm[20]。材料微型化导致了纳米颗粒的比表面积显著增加，提高其整体性能。纳米材料聚合物非常适合应用于食物的储存，因其微小的结构降低了气体的渗透能力，将纳米颗粒涂层在食品外能避免氧气与其他物质的侵蚀[21]。一种纳米颗粒涂层益生菌微胶囊的技术已获得专利，经过蛋白质、多糖与纳米颗粒的3层包被，使得益生菌具有优良的耐热性、耐酸性和耐胆汁性[22]。Alireza等[23]使用生物纳米复合材料对芽孢杆菌微囊化，发现果胶、纳米甲壳素和纳米木质纤维素以2:1:1复合使用对胃肠道环境具有良好的抗逆作用，这是由于纳米纤维的非水溶性抵抗了微胶囊在胃肠道内的消化降解。

3 益生菌微囊化包被的方法

益生菌常用挤压法、乳化法、喷雾干燥法等微囊化技术进行包囊[24]，在此基础上选用合适的包囊材料进行封装，提高益生菌的包埋率以及对不利因素的耐受能力。

3.1 挤压法 挤压法是一种很早就存在的微囊化技术[25]，是将芯材与壁材混合的过程，并通过一系列模孔，用压力将混合悬浮溶液挤入凝固液中，当混合物接触凝固液时，壁材析出将芯材包裹并发生硬化的过程。挤压法加工过程条件温和，操作简单，但微胶囊粒径较大。Chen等[26]将乳酸菌与黄原胶混合，逐滴滴入壳聚糖溶液形成微胶囊，通过单因素试验提高了包埋率，进一步优化了嗜酸性乳酸菌微胶囊的制作。Arain[27]在使用挤压法包埋乳酸片球菌的过程中发现微胶囊的结构随着壳聚糖pH与黄原胶浓度的改变发生变化。Seth等[28]在挤压法的基础上加入喷雾手段，使微囊化后嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌的存活率分别达到24.8%与72.6%。

表1 常用益生菌微囊化的多糖类壁材[11]

3.2 喷雾干燥法 喷雾干燥法是将液体通过喷雾干燥器喷成雾滴形态，并且依靠干燥介质与雾滴的均匀混合，进行热交换和质交换，最后使溶剂气化或溶解物固化形成微胶囊。喷雾干燥法具有干燥速度快、产品纯度高、生产简单利于连续化生产等优点，但由于干燥温度较高，较适用于热敏性物质[29]。Ying等[30]使用氢化棕榈仁硬脂、水解乳清蛋白和糊精化的木薯淀粉作为微囊化壁材，与冻干的鼠李糖乳杆菌（LGG）混合通过喷雾干燥机制成LGG微胶囊，并考察了壁材中加入抗氧化剂抗坏血酸钠和生育酚对微胶囊中LGG存活能力的影响，结果表明抗坏血酸钠对微胶囊中LGG的存活有不利影响，生育酚则有利于LGG的存活。Mahsa等[31]采用喷雾干燥法将LGG与壁材乳清蛋白（WPⅠ）、菊粉（ⅠN）、波斯胶（PG）混合，调整喷雾干燥机进口温度100 、出口温度60 制作微胶囊，该微胶囊在模拟胃液、肠液作用下以及储存过程中都提高了乳酸菌的存活率，且粒径分布均匀。Yao等[32-33]通过喷雾干燥法成功制作了戊糖片球菌和乳酸杆菌微胶囊，使益生菌长期储存，降低了益生菌在胃传递过程中的损失，同时发现微胶囊中加入MgO对益生菌的储存、耐热与耐酸等各方面都具有提高作用。

3.3 冷冻干燥法 冷冻干燥法是一种传统的保存细菌的方法。益生菌与壁材混合后在-90～-40 被冷冻，然后在低压较高温下直接升华，最后得到多孔微胶囊[34]。因为在冷冻干燥时容易对细胞造成伤害，所以往往需要加入各种低温保护剂[35]。Mahsa等[31]在-80 冷凝，0.02 mbar真空压下将LGG与壁材（乳清蛋白、菊粉、波斯胶）混合液在单室冷冻干燥机中冷冻干燥24 h以上制得微胶囊，该冻干微胶囊有利于乳酸菌在消化系统环境中存活。冷冻干燥法并不是一种温和的微囊化技术，现在更多研究者往往将这种方法与其他微囊化技术结合以充分发挥其干燥功能。如将嗜热链球菌的壳聚糖/海藻酸钠微胶囊冷冻干燥后，其微胶囊在以海藻糖和脱脂牛奶作为冻干保护剂时，冻干存活率可高达82.54%[36]。Shoji等[37]对嗜酸性乳酸菌先采用复凝聚法后采用冷冻干燥法制备了微胶囊，提高了乳酸菌各方面的耐受能力，同时微囊化乳酸菌在长达120 d 的冷藏条件下活菌数依然高于107CFU/g。

3.4 乳化法 乳化法是将细胞与载体混合，形成油包水或水包油的均匀乳液体系，加入稳定剂后，在液滴表面形成保护层，得到微胶囊[38]。与挤压法一样，乳化法也不需要复杂的设备，更易于工业化生产，微胶囊粒径较小。乳化法制备海藻酸钠微胶囊又可分为内源乳化法和外源乳化法[39-40]。阳晖[41]在制备肠溶性嗜酸乳杆菌的过程中发现，内源乳化法制备的微胶囊包埋率更高，可达72.5%。赵萌等[42]采用内源乳化法制备嗜酸乳杆菌微胶囊，发现海藻酸钠与魔芋葡甘糖作为壁材提高了微胶囊对乳酸菌的保护作用，且保护效果与魔芋葡甘糖的分子量大小有关。Zhang等[43]在喷雾干燥微粒的基础上采用乳化的方法将唾液乳杆菌进行了多层微囊化，认为S/O/W乳化系统可以对益生菌起到良好的保护作用。

3.5 复凝聚法 凝聚法是将芯材稳定地乳化分散在壁材溶液中，通过加入某一物质或调节溶液pH和温度，或采取某些特殊方法，降低壁材的溶解度，使壁材析出凝聚包裹在芯材周围，形成微胶囊。复凝聚法则是2种壁材由于相反电荷的相互作用使溶解度降低形成微胶囊的过程。该方法的操作过程较为温和，微胶囊产品制作速度快[44]。贺红军等[45]以明胶和阿拉伯胶作为壁材，采用复凝聚法对嗜酸乳杆菌进行微囊化，找到了微胶囊制备的最佳工艺条件，提高了嗜酸乳杆菌的储藏稳定性、包埋率、耐酸性等方面抗逆性。Ribeiro等[46]提出与其他微胶囊技术相比，复凝聚法制作的微胶囊对益生菌的保护效果更佳。选用乳清蛋白/果胶对嗜酸性乳酸菌进行复凝胶微胶囊制备，证明了复凝聚微囊化对乳酸菌起到了保护作用[47]。将复凝聚法同其他干燥方法结合可以提高益生菌氧化稳定性和存活能力[48]。

4 微胶囊化对益生菌抗逆特性的作用效果

4.1 耐酸性能 一般来说，抵抗胃酸保护益生菌安全地进入肠道是所有微胶囊都需具备的能力[49]。Mahsa等[31]选用3种微囊化干燥技术（电子喷雾、冷冻干燥、喷雾干燥）对LGG进行包被，结果显示3种干燥方法对乳酸菌微胶囊的耐酸能力差异显著，其中冷冻干燥和喷雾干燥的微胶囊对乳酸菌更具保护作用。Yao等[33]认为，在微胶囊中加入MgO提高了微胶囊的耐酸性可能是由于MgO中和了酸性环境中的H+，从而减轻了细胞承受的酸性压力。Gebara等[47]研究发现，复凝聚法制备的微胶囊壁材乳清蛋白/果胶并没有在胃酸环境中对嗜酸性乳酸菌起到额外的保护作用，而Gerez等[50]提出乳清蛋白/果胶的双层微胶囊在胃酸环境中提高了乳酸菌的存活能力。当将保加利亚乳杆菌微胶囊与菌液同时冻干后，经模拟胃液处理2 h后，检测到冻干微胶囊与冻干粉活菌数分别为 1.24×109、4.3×104CFU/g[51]。大多数的微胶囊能增强益生菌的耐酸能力，这对口服的益生菌产品意义重大。

4.2 耐高温性能 众所周知，高温会对大多数的益生菌造成伤害，甚至直接导致益生菌死亡。在各种食品和饮料加工过程中，巴氏消毒法作为一种重要的消毒手段，虽然加热温度只到达60～82 ，但对许多益生菌来说仍是致命的。Yao等[32]将微胶囊进行15 min和30 min的63 加热处理后，使用共聚焦显微镜观察乳酸菌的活菌数，结果证实微囊化确实显著提高了乳酸菌的热稳定性，而含海藻酸钠/明胶的微胶囊较单独的海藻酸钠微胶囊对乳酸菌的保护更佳。张琳等[52]使用乳化法制作的粪肠球菌微胶囊能在110、130 高温下存活，耐热性能较菌粉显著提高。周奕先等[51]进行高温试验确定冻干过程可以提高菌体的耐高温能力，且微胶囊冻干后的效果优于冻干粉。通过挤压技术，选用淀粉、海藻酸钠与壳聚糖对乳酸菌和双歧杆菌微囊化，在热处理试验中发现在55 和60 条件下的微胶囊保护效果显著优于游离乳酸菌，而在65 加热30 min后，微胶囊只对封装的双歧杆菌具有保护作用[53]，说明同样的微囊化处理对不同益生菌作用不同，这需要研究者根据需求与益生菌的个体差异性，对不同益生菌进行特定的微囊化处理。

4.3 耐湿性能 环境中的相对湿度可能是影响益生菌微胶囊理化性质的一大因素。在恒定温度下，Ying等[30]制作的微胶囊中LGG的存活能力随着相对湿度的升高而降低，25 条件下在相对湿度分别为32%、57%、70%环境下壁材中加入生育酚对微囊的耐湿性能有所提高。以脱脂乳/虫胶/脂质为壁材的3壳层包囊LGG微胶囊在25 、70%相对湿度条件下储存56 d，检测到微囊内LGG菌数为4.3 log10CFU/g，比单层脱脂乳包囊的LGG微胶囊提高了1.3个log值[54]。张玉华等[55]制备双歧杆菌和嗜酸乳杆菌二联活菌微胶囊，在相对湿度60%～65%下保存3个月后，加有保护剂的微胶囊内活菌存活率为13.28%，而无保护剂的微胶囊内活菌存活率仅为0.38%。

4.4 储存性能 功能性食品需要益生菌在长时间的保存期内仍然具有活性效益，在微囊化过程中会发生细胞损伤和蛋白质失活，但在储存过程中的脱水、氧化同样会对微胶囊中的益生菌产生伤害，从而影响益生菌的储存性能[37]。乳酸菌在储存期间的大量死亡主要是由于膜脂质的氧化，所以储存过程中的温度和湿度是影响乳酸菌储存性能的重要因素[56]。Ying 等[30]的喷雾干燥微胶囊在保存过程中（4 和25 ；32%、57%和70%相对湿度），所有壁材配比制得的微胶囊在4 和32%相对湿度条件下储存性能最佳。Shoji等[40]通过复凝聚法制得微胶囊，再进行冷冻干燥，分别在7 和37 下储存，结果显示在最初含有9.70 log10CFU/g乳酸菌的微胶囊中，7 条件下存储120 d活菌数仍有7.23 log10CFU/g；而在37 条件下，随着储存时间的增加，活菌数显著降低，30 d时只有6.47 log10CFU/g。与大多数研究的数据一致，低温更利于益生菌微胶囊的储存。除了储存条件，微胶囊的制作方法与壁材的选择配比同样影响着微胶囊的储存性能。Mahsa等[31]试验得出冷冻干燥能提高乳酸菌的储存稳定性。Yao等[33]通过SEM图像观察到，MgO可能是通过填充微胶囊内的孔隙来抑制氧离子和氢离子进入微胶囊，从而延长益生菌的储存时间。朱守创[54]研究发现，葡萄糖能保护LGG细胞膜，从而提高了LGG的储存性能。

4.5 其他因子 除了以上几种环境压力，如胆汁、酶以及其他物质都有可能对微胶囊中的益生菌造成损害。Mahsa等[31]将制备的乳酸菌微胶囊分别置于4%NaCl、2%NaCl、胆汁、青霉素G和溶菌酶中，结果显示冷冻干燥与喷雾干燥法制得微胶囊中乳酸菌的死亡率相对较低，电子喷雾微胶囊中乳酸菌死亡率最高；同时，壁材中加入波斯胶对乳酸菌抵抗这些不利因子具有显著性效果。杨柳等[57]制作了免疫乳与双歧杆菌复合微胶囊，发现胆汁盐浓度越高对微胶囊中的双歧杆菌伤害越大，但是复合微囊化确实能保护双歧杆菌，在高浓度胆汁盐处理3 h后，活菌数可达到67.7%。

5 国内饲用益生菌微囊化的应用

目前，微囊化技术在各领域都已成为重点，其在饲料工业领域虽被看好，但仍处于起步阶段，微囊化给益生菌带来了极大的保护作用，这必然引起饲料领域研究者的兴趣。张慧等[58]在育肥猪的基础日粮中添加微胶囊益生菌，发现0.5 kg/t的益生菌显著提高了育肥猪的日增重，降低了耗料增重比，同时增加了猪肠道内乳酸杆菌和双歧杆菌数，减少了大肠杆菌数。为了克服植物乳杆菌与泰山松花粉多糖（TPPPS）受胃酸与酶的压力，马宁等[59]通过制备微胶囊再饲喂老鼠，制得的微胶囊包埋率达到了81.6%，并且饲喂微胶囊能提高老鼠小肠中的乳酸菌数量，减少大肠杆菌数，促进老鼠体重增加。张琳[38]采用乳化法制备的布拉迪酵母菌和粪肠球菌微胶囊，都显著改善了肉鸡的生产性能、免疫功能与肠道黏膜形态，也能很好地缓解小鼠的急性溃疡性结膜炎。

6 展 望

微囊化技术由于能提高益生菌多方面的耐受性能，已经被广泛应用于各行业，但技术尚不成熟。首先，微囊化选择的材料比较局限，种类较少，同样的微囊化技术不能对所有的益生菌达到一致的保护效果；其次，微囊化方法有待进一步提高，与原先单一的微囊化方法不同，现在越来越多的研究者会选择多种微囊化方法结合使用，最大化提高微囊化质量。目前，我国的畜牧养殖依然存在着布局不合理、环境不舒适等问题，益生菌添加剂在使用和储存环境中也将受到各种影响，需要为饲用益生菌提供更多的保护。

在微囊化领域内，将纳米技术与微囊化技术相结合已成为一大热门，纳米微粒的使用可大大提高其对益生菌的保护作用，发挥更大益生效果。如何引入更多的纳米材料，使用更高效的纳米封装技术并应用于益生菌中还需要研究者更多努力。另一方面，每一种益生菌都有其独特的性质，在微囊化过程中，不同的操作方法、不同的参数条件都可能影响微胶囊对益生菌的保护效益。因此，每一种微囊化技术都需要不断进行深入研究，针对不同种类益生菌构建相应适宜的微囊化包被方法，创新微囊化技术运用于益生菌产品生产。