光化学法对豚鼠膜外半规管微循环的影响

吕凡 王利一 黄魏宁 宋海涛 龚霞 刘旭晖

光化学法是用四碘四氯荧光素二钠(rose bengal, RB, 分子式C20H2O5Cl4I4Na2)体循环注射结合540±40 nm的绿光照射，使受照射区域产生单分子氧和自由基破坏血管内皮，激活血小板导致局部微血栓形成，进而导致缺血[1,2]。目前光化学法是最常用的微循环缺血造模方式，常用于大脑微循环缺血研究；在内耳领域，张学渊等[3]指出光化学反应导致血栓形成的过程与病理状态下内皮细胞受损、基底膜暴露激活血小板致血栓形成的过程基本一致；钟贞等[4]运用此项技术诱导豚鼠耳蜗缺血并进行了溶栓治疗。我们曾在前期研究中将光化学法作用于豚鼠前庭系统，冰水试验显示豚鼠眼震频率下降[5]。本研究试图用光化学法诱导豚鼠急性半规管缺血障碍，通过组织病理学观察，探讨光化学法是否能够对豚鼠半规管微循环产生形态学影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康白色红目豚鼠24只，雄性，体重250～350 g，由北京协和医科大学实验动物研究所提供，耳廓反射灵敏。随机分为实验组12耳，对照组12耳，均以左侧为实验耳。

1.2主要的试验仪器 实验动物保温手术台(北京半导体设备一厂)；卤素灯冷光源(町田制作所，日本)；光导纤维(直径3 mm, Olympus, 日本)；滤光片(清华大学光电系540±40 nm)。

1.3光化学法诱导内耳缺血 两组豚鼠均用10%水合氯醛150 mg/kg进行腹腔注射麻醉，取耳后径路，沿左耳后乳突正中作1 cm长切口，暴露左侧听泡，磨去部分颞骨，暴露上鼓室；剪断砧骨，磨去镫骨前后脚，仅保留镫骨足板，注意保持鼓膜的完整；清理术区，充分止血。将波长为540±40 nm的滤光片经水软化后，置于上鼓室颞骨内侧壁内，其下缘与圆窗上缘平齐；然后，行颈部正中切口2 cm，分离皮下软组织、肌肉和筋膜，找到气管；在气管旁分离左侧颈外静脉，用直径1 mm的黑色导管行静脉插管，实验组以20 mg/kg的剂量注射2%四碘四氯荧光素二钠，注射时注意染料的避光；对照组注射生理盐水0.5 ml，注射完后开启150 W的卤素灯冷光源，将连接好的光导纤维，经滤光后形成波长为540±40 nm、光强为500～600 mW/cm2的绿色光束，垂直照射，其末端与被照射部位相距0.5 cm，持续30 min。光照结束后取出光纤管和颈静脉导管，结扎左侧颈外静脉，用骨蜡填封耳后骨缺损，缝合组织创面。

1.4组织病理学观察 手术完成后两组各取4耳立即作膜半规管分离铺片观察，其余8耳5天后取术侧颞骨作石蜡切片观察。

膜半规管分离铺片：打开上鼓室的外壁和上壁，用钻针在外半规管凸和上半规管凸处钻孔，同时在蜗窗后下方的后半规管凸处钻孔。用血管钳咬开孔周骨壁以充分暴露三个膜壶腹，用微细分离针将三个壶腹嵴基部的神经和血管从骨壁上截断，使三个膜壶腹游离；用钻针在半规管单脚和总脚处钻孔并在半规管进入椭圆囊的入口处截断膜性半规管，轻轻抽出整个膜外半规管。将取下的膜半规管在载玻片上的HE染液滴中染色10分钟，将膜外半规管铺放在载玻片上的甘油中，在放大16～25倍的解剖显微镜下观察。

壶腹嵴石蜡切片：将颞骨组织用10%福尔马林溶液固定24小时以上, 将颞骨组织浸入5%硝酸溶液中脱钙5小时，流水冲洗3小时后排出组织气泡，进行脱水，浸蜡，包埋，切片。将切片进行HE染色、脱水、透明、封固，光学显微镜下观察染色结果。

2 结果

2.1两组动物一般情况 术后24小时实验组豚鼠在静止时均出现向左侧频繁和细小的晃头动作，有细小的肌肉震颤；活动时肌肉震颤更加明显，晃头加剧，步调协调性差，躯体呈"C"形，向左侧转圈运动，易出现左侧翻滚，不能主动饮水，需要人工辅助方可饮水、进食；而对照组仅有2只出现头部的轻度摇摆，步调协调性正常，无转圈样运动。随天数的增加，实验组豚鼠肌肉震颤逐渐减轻，步调渐趋协调，爬行弧度渐小，翻滚次数减少, 在5天内逐渐趋向正常。对照组有两只出现静止时向左侧晃头活动和轻度肌肉震颤，2天内即消失，未出现上述其它变化。

2.2膜外半规管分离铺片观察结果 膜外半规管分离铺片HE染色示，实验组术后有1耳(图 1a)出现大范围的毛细血管网萎缩、闭塞，膜外半规管和壶腹嵴缺血状态严重，另外3耳(图1b)缺血状态较轻，在膜外半规管中段有2～3 mm的无血流区，周围有少量毛细血管收缩，但无大片的毛细血管萎缩闭塞现象。对照组膜外半规管毛细血管网无明显改变(图2)。

2.3壶腹嵴石蜡切片观察结果 石蜡切片示，实验组壶腹嵴毛细血管网均有不同程度的萎缩、闭塞，部分毛细胞变性、坏死，主要表现为：细胞肿胀，细胞界限模糊，细胞内出现大量的白色空泡区，纤毛融合、倒伏甚至缺失；膜半规管形态异常，扭曲变形，网状纤维萎缩，毛细血管闭塞，仅见少量红血球。对照组壶腹嵴细胞界限清晰，纤毛清晰可见；壶腹嵴和半规管血流丰富，半规管管腔基本呈圆形，网状纤维无萎缩。两组均未见到广泛的纤维化和骨化，椭圆囊、球囊毛细胞无明显异常(图3～6)。

3 讨论

前庭迷路缺血或梗死以及内耳微循环障碍被认为是引起血管性眩晕的主要原因之一。动物模型研究发现迷路动脉血流中断5分钟可引起内耳终器的点状变性，迷路动脉主干完全梗阻能引起膜迷路的严重变性，而分支的微小栓塞则导致局限性的点片状坏死，严重受损时膜迷路能形成广泛的纤维化和骨化[6,7]；从一般的变性到严重的纤维化、骨化，内耳终器的病理改变取决于内耳血管受损的机制、严重程度以及持续时间[8～10]。临床上椎-基底动脉供血不足或闭塞及脑干梗死等脑血管疾病导致的眩晕和平衡功能障碍不是因其最终影响到脑干、大脑、小脑、前庭神经核等神经中枢，而是在疾病发展过程中使支配内耳的内听动脉血流量减少，从而影响前庭平衡器官血供所致。 Millikan等[11]指出血小板纤维素栓子堵塞微血管造成前庭迷路缺血引发的眩晕较严重，常伴恶心、呕吐、眼球震颤、共济失调，并且因头部活动而加重；症状可持续几天到几周，逐步缓解；恢复功能后仍可遗留偶发、短暂的眩晕发作和单侧前庭功能异常，但国内外文献缺乏有关前庭系统特别是针对膜半规管微循环缺血的动物模型研究作为支持。光化学法是最常用的大脑微循环缺血造模方式，也曾多次成功应用于耳蜗微循环缺血研究，本研究试图以光化学法诱导豚鼠膜外半规管缺血，以期获得半规管微循环缺血模型的初步数据。

图1 实验组膜外半规管分离铺片(×200倍) 1a毛细血管网大面积萎缩、闭塞;1b毛细血管网中段明显萎缩、闭塞。 图2 对照组膜外半规管分离铺片(×200倍) 2a、2b均显示膜半规管毛细血管网无明显改变。

图3 实验组膜半规管形态(×200倍) 可见异常,扭曲变形,网状纤维萎缩,毛细血管闭缩,仅见少量红血球。 图4 对照组膜半规管形态(×200倍) 管腔基本呈圆形,网状纤维无萎缩,血管充盈清晰可见。 图5 实验组壶腹嵴(×200倍) 可见毛细血管网均有不同程度的萎缩、闭塞,部分毛细胞变性、坏死,主要表现为:细胞肿胀,细胞界限模糊,细胞内出现大量的白色空泡区,纤毛融合、倒伏甚至缺失。 图6 对照组壶腹嵴(×200倍) 结构清晰,毛细胞、纤毛均正常。

根据豚鼠内耳解剖的特点，豚鼠前庭感受器位于鼓室内壁上后部，可以设想一个以椭圆窗后缘顶点为圆心，半径为5 mm的向上的扇形区域(耳蜗不在其内)，该区域可涵盖椭圆囊区、球囊区、三个半规管骨突和壶腹嵴区[12]。本实验中光照前充分暴露该区域，清除表面积血后将滤光片置于其上，然后进行光照。光照区外半规管受光照最直接，因而本研究选择外半规管作为光照区域；在调配、注射光敏剂时应注意避光，在进行光照时注意对受照区的监控，防止偏移；注意手术时间(前期工作中因为手术时间过长，术中豚鼠死亡8只)，如果手术时间超过3小时，豚鼠术后生存率会受很大影响。另外，抽取膜外半规管须在显微镜下精细操作，否则极易将其离断。

光镜下，正常膜半规管表面有毛细血管呈弧形，沿半规管平行状纵轴走行，毛细血管并非为直线样，而是有许多曲折，血管之间缺乏沟通。本实验膜半规管分离铺片显示：实验组术后有1耳出现大范围的膜半规管毛细血管网萎缩、闭塞；另外3耳在膜半规管近中段有2～3 mm的无血流区，周围有部分毛细血管收缩，但无大片的毛细血管萎缩闭塞现象。推测半规管是呈3个相互垂直、弯曲成2/3个环形的中空骨管，而在前庭窗上部的外半规管骨突是最为表浅的部位，术中所受光照较半规管其他区域更强，因而出现更为明显的缺血表现。石蜡切片显示膜外半规管横断面，实验组膜外半规管形态异常，扭曲变形，网状纤维萎缩，毛细血管闭缩，仅见少量红血球，说明缺血状态依然存在；壶腹嵴下毛细血管网均有不同程度的萎缩、闭塞，壶腹嵴部分毛细胞变性、坏死，缺失；对照组壶腹嵴细胞界限清晰，纤毛清晰可见，壶腹嵴血流丰富。说明实验组豚鼠外半规管局部缺血条件下，短期内壶腹嵴毛细胞的结构没有明显的改善。实验组未见到明显的纤维化和骨化，推测可能观察时间较短，纤维化和骨化尚未形成。前期研究中冰水试验显示实验组眼震频率较对照组低，差异有统计学意义，而振幅和持续时间上的差异没有统计学意义[3]，本实验观察也发现实验组豚鼠术后出现了明显的晃头动作和肌肉震颤，步调协调性变差，说明实验组豚鼠出现了一定程度的前庭功能障碍。

文中结果显示，两组均未见到椭圆囊和球囊的毛细胞明显异常，说明光化学法对这两处前庭感受器不敏感，可能是因为其位置较深，光照不够充分，尚需进行进一步研究证实。

综上所述，光化学法可以作用于豚鼠壶腹嵴、外半规管，破坏其局部微循环，激发急性缺血状态，能在一定程度上模拟病理状态下的急性外半规管缺血；具有方法简便、效果明显、重复率高的特点，可以为进一步研究急性血管性眩晕发病机理提供参考。