月之汤方对小鼠免疫功能影响的实验研究

1.广禾堂草本生物科技(上海)有限公司，上海 200030；2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006

哺乳期妇女分娩过程中大量消耗体力，产后身体虚弱，免疫力较低，易感染疾病[1]。中国现存最早的妇产科专著《妇人良方大全·产后门》中提到，产妇产后不注重调理，则“小可虚羸，失于将补，便成大患，终身悔而不及”，“经云妇人非止临产须忧，产后大须将理，慎不得恃身体和平取次为之。乃纵心恣意，无所不为。若有触伤，便难整理。犯时微若秋毫，感病重如山岳，知命者可不谨之！”[2]。同时，产妇身体机能与乳汁的分泌量、婴儿生长发育都具有密切关系，需要重视[3]。因此，乳母应提高哺乳期间免疫功能，预防疾病的发生，确保母婴健康。

现代研究认为，中药多糖、皂苷类等成分具有调节免疫功能的作用，从根本上提高乳母的抗病能力[4]。月之汤方所含桔梗、山药、芡实、黄精、薏苡仁等中药，可增强产后妇女免疫活性，调节产后妇女免疫功能[5]。为观察月之汤方对小鼠免疫功能的影响，本实验通过建立小鼠免疫缺陷模型，测定小鼠血液白细胞总数和淋巴细胞数计数、小鼠细胞免疫功能及体液免疫功能、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，为其增强哺乳期妇女免疫功能提供科学依据。

1 实验材料

1.1 药品及试剂 月之汤方(广禾堂草本生物科技(上海)有限公司，批号20170326)，生脉胶囊(正大青春宝药业有限公司，批号20161201)，氢化可的松注射液(安阳九州药业有限责任公司，批号140820001A)。

1.2 动物 昆明种SPF级小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重18～22g，购自南方医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK( 粤) 2011-0015。

1.3 仪器 XE-2100型全自动血细胞分析仪(希森美康医用电子(上海)有限公司)，PS-2013秒表(深圳市追日电子科技有限公司)，ME204E102型万分之一天平电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

2 方法和结果

2.1 样品液配制 受试样品配制：月之汤方加热水溶解，配制成0.5、1、1.5 g·mL-1的混悬液。对照组药物样品配制：取生脉胶囊9粒(0.06 g·mL-1) ，用研钵研碎呈粉末后加水至50 mL，临用前现配。

2.2 对小鼠血液白细胞总数和淋巴细胞数的影响[6]取昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、模型组、月之汤方低剂量组( 5.2 g·kg-1)、中剂量组(10.4 g·kg-1)、高剂量组( 15.6 g·kg-1)、阳性药物组(0.6 g·kg-1)，每组10只，按10 mL·kg-1灌胃给药，空白及模型组给予等体积蒸馏水。每日灌胃1次，连续灌胃给予受试物30天，实验期间自由进食。于第3周后，建立小鼠免疫缺陷模型，各组动物肌肉注射免疫抑制剂氢化可的松40 mg·kg-1，共5次，间隔24 h，在末次注射给药后次日测定各项指标，进行组间t检验分析。

实验第31天利用摘除小鼠眼球的方法采集全血。采用无菌洁净的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，使血液自由滴入装有抗凝剂的1.5 mL离心管中。采血过程中将血液与抗凝剂不断摇匀，防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1 mL。上机前将血液颠倒混匀，过程中注意检查其是否存在凝块，并于24 h内应用全自动血细胞分析仪对小鼠血液样品中白细胞总数和淋巴细胞数进行检测。

2.3 对小鼠细胞免疫功能的影响[7]分组、给药及造模同2.2，实验第25天，使用脱毛剂除去小鼠右侧背中部的毛发。实验第26天，使用微量加样器于小鼠脱毛部位滴涂5% 2,4-二硝基氟苯溶液(DNFB)20μL致敏。实验第30天，小鼠左耳壳(两面)滴涂1%DNFB溶液20μL作为攻击；小鼠右耳滴涂丙酮、麻油混合液20 μL作为对照。实验第31天(即攻击后24 h)，称取各小鼠体重并颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳，用打孔器取下直径8 mm的耳片，立即称重。以(左耳片重量-右耳片重量)为耳廓肿胀度表示迟发型超敏反应(DTH)的强度。同时，取小鼠胸腺、脾脏称重，以小鼠脾脏、胸腺湿重(mg)各作为脾脏指数和胸腺指数。计算公式见公式1。

公式1

2.4 对小鼠体液免疫功能的影响[8]分组、给药及造模同2.2。实验第26天，每只鼠腹腔注射压积为2%(V/V)绵羊红细胞(SRBC)0.2 mL进行免疫。间隔4天后，摘除小鼠眼球并取血于离心管内，放置约1 h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000 r·min-1离心10 min，收集血清。用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔100 μL，再加入0.5%(V/V)的SRBC悬液100 μL，混匀，装入湿润的平盘内加盖，于37℃温箱孵育3 h，观察各组小鼠血球凝集程度。

其中，血清凝集程度一般分为5级(0-Ⅳ)记录，按公式2计算抗体积数。若受试样品组的抗体积数显著高于对照组的抗体积数，则可判定该项实验结果为阳性。

抗体积数=(S1+2S2+3S3……nSn)

公式2

式中1、2、3……n代表对倍稀释的指数，S代表凝集程度的级别，抗体积数越大，表示血清抗体越高。

0级红细胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圆点状，四周液体清晰。

Ⅰ级红细胞大部分沉集在孔底成园点状，四周有少量凝集的红细胞。

Ⅱ级凝集的红细胞在孔底形成薄层，中心可以明显见到一个疏松的红点。

Ⅲ级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层,中心隐约可见一个小红点。

Ⅳ级凝集的红细胞均匀地铺散在孔底成一薄层，凝块有时成卷折状。

2.5 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响[9]分组、给药及造模同2.2。实验第28天，小鼠腹腔注射6%淀粉液1 mL，连续注射3日。3日后，小鼠腹腔注射1%的鸡红细胞悬液2 mL，轻揉腹部使鸡细胞分散。25～30 min椎脱臼法处死小鼠并对小鼠腹腔注射生理盐水2 mL。在干净的载玻片上滴加一滴生理盐水，同时向其中滴加一滴小鼠腹腔液。静置10 min，腹腔巨噬细胞贴壁后，弃去生理盐水，并对稍干后的标本滴加3～4滴瑞氏染液进行染色，以完全盖住标本为宜。5 min后甩去标本玻片上多余染液，自来水轻洗，吸水纸吸干，干燥后油镜镜检。按公式3和公式4分别计算吞噬百分率及吞噬指数，进行组间比较。

公式3

公式4

3 结果

3.1 对小鼠血液白细胞总数和淋巴细胞数的影响 月之汤方5.2、10.4、15.6 g·kg-1剂量组的白细胞总数和淋巴细胞数显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

表1 月之汤方对小鼠白细胞总数及淋巴细胞数的影响 ±s,n=12)

注：与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01。

3.2 对小鼠细胞免疫功能的影响 月之汤方5.2 g·kg-1剂量组耳廓肿胀度、脾脏指数显著低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。

表2 月之汤方对小鼠细胞免疫功能的影响 ±s,n=12)

注：与模型组比较，*P<0.05。

3.3 对小鼠体液免疫功能的影响 月之汤方5.2、10.4 g·kg-1剂量组的抗体积数分别为27.77±9.55、30.55±7.88，均显著高于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果见表3。

3.4 对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响 月之汤方5.2、10.4、15.6 g·kg-1剂量组的吞噬百分率显著高于模型组，月之汤方5.2 g·kg-1剂量组的吞噬指数显著高于模型组，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果见表4、图1。

表3 月之汤方对小鼠体液免疫功能的影响 ±s,n=12)

注：与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01。

表4 月之汤方对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响 ±s,n=12)

注：与模型组比较，*P<0.05、**P<0.01。

4 讨论

传统中医学理论认为产后妇女具有气血亏损，脏腑虚弱，瘀血阻滞，心气不足，易感风寒的生理特点[10]。产妇作为特殊人群，在增强其免疫功能方面应给予充分重视。

月之汤方源自生化汤裁剪变化而成[10]，生化汤被誉为“血块圣药”，是治疗产后诸症的重要代表方剂。传统中医学理论认为产后用药原则应以补气养血、调和脾胃为主，月之汤方含有桔梗、山药、芡实等多种中药，其所含有的天然多糖、皂苷类等成分已被证明具有抗肿瘤和免疫增强的作用，而其他成分往往起协同或辅助增强免疫作用[11]。

白细胞总数及淋巴细胞数可衡量机体接受免疫抑制剂后的免疫应答功能，脾脏和胸腺的相对重量、吞噬百分率及吞噬指数均是衡量机体非特异性免疫功能的重要指标。本次实验结果提示月之汤方为免疫增强剂，能够明显增加小鼠血液白细胞总数和淋巴细胞数，提高小鼠细胞免疫与体液免疫功能，可不同程度提高抗体活性。

综上所述，月之汤方能够调节人体免疫机能，增加人体免疫力，为其开发成增强免疫类保健食品提供理论依据。