单因素结合响应面法优化蒙香青兰总酚含量测定方法

侯 悦 石金刚 李 德 张丽萍 王占黎 靳 敏

(包头医学院，内蒙古 包头 014040)

香青兰(Dracocephalum MoldavicaL.)为蒙古族习用药材，青兰属唇形科一年生草本植物，在内蒙古、甘肃、青海及新疆等省份均有分布[1]。因其较高药用价值，蒙香青兰在蒙医临床中应用广泛。现代研究表明，该药材具有缓解心绞痛症状,抑制心肌缺血再灌注损伤,抗脂质过氧化损伤等作用[2]。香青兰全草中含有酚类、黄酮类、萜类和微量元素等物质[3]。其中酚类物质具有抗氧化、强化血管壁、促进肠胃消化、降低血脂肪等作用，这与蒙香青兰的药理作用密切相关[4]。本文对蒙香青兰中总酚含量的测定方法进行了探讨，为进一步研究蒙香青兰中酚类物质奠定基础。

植物中总酚含量的测定方法主要为福林酚比色法[5]。文献查阅得出，不同植物的福林酚比色法检测条件存在较大差异[6]。因此，本实验通过单因素结合Box-Behnken响应面法，以吸光度为指标，对福林酚比色法测定蒙香青兰总酚含量的方法进行优化，最后通过方法学实验评价其准确性及合理性[7-8]。

1 材料与仪器

1.1 仪器与设备 UVmini-1240紫外可见分光光度计(SHIMADZU)，T6新悦-可见分光光度计(普析通用)，DFX-4C200克密封型摇摆式粉碎机(广州市大祥电子机械设备有限公司)，JB-60D数显恒速搅拌机(上海精密仪器仪表有限公司)，电热恒温水浴锅(上海科恒实验发展有限公司)，SHZ-Ⅲ循环水真空泵(上海知信实验仪器技术有限公司)，RE-2000ARE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，TYXH-I漩涡混合器(姜堰市天仪电子仪器有限公司)，天马FA2004电子天平，双嘉冷冻干燥机，BSV10油旋片式真空泵(宁波鲍斯能源装备股份有限公司)

1.2 材料与试剂 蒙香青兰全草2015年8月购买于内蒙古通辽市，全草用电动粉碎机制成粉末，装于塑料袋，放置于干燥阴暗处备用。

福林酚试剂(SIGMA公司)，DMSO(SIGMA公司)，没食子酸标准品(国药集团化学试剂有限公司，批号为20150409)，碳酸钠，乙醇，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯等试剂均为国产分析纯，去离子水。

2 实验方法

2.1 蒙香青兰总酚提取物的制备 取适量干燥的蒙香青兰植物粉末，用40%乙醇，于65℃下提取两小时，过滤得总酚提取液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯进行萃取，得乙酸乙酯提取物，旋干并冻干，得到干燥的蒙香青兰总酚提取物粉末备用。

2.2 初定反应体系 预实验中蒙香青兰总酚的反应体系暂定为：取2.1中的蒙香青兰总酚提取物溶于DMSO，配成2.0mg/mL的蒙香青兰总酚试液。后取0.05mL试液于10mL比色管中，加入3.95mL去离子水漩涡混匀后，再加入0.25mL福林酚试剂，漩涡混匀并避光静置5min。之后加入20%碳酸钠0.8mL，漩涡混匀后加去离子水定容至10mL，摇匀，室温下避光反应150min，在一定波长下测吸光度[9]。

2.3 最大吸收波长的确定 取适量蒙香青兰总酚试液及没食子酸标准溶液，参照2.2显色反应，在500～800nm进行全波段扫描，以确定最大吸收波长。

2.4 影响蒙香青兰总酚含量测定的单因素考察 分别以福林酚试剂的体积(mL)、20%碳酸钠溶液的体积(mL)、水浴温度(℃)、水浴时间(min)为单一自变量，固定其他变量，以吸光度为因变量，对单因素进行考察分析。

2.5 响应面优化实验 在2.4实验结果的基础上，响应面优化实验的考察因素确定为：福林酚试剂体积(A)、20%碳酸钠溶液的体积(B)、水浴温度(C)，根据Box-Behnken中心组合设计原理，分别以各因素在单因素实验中得到的最佳值为中心，围绕最佳值上下各取1个水平作为响应面的水平，以吸光度为考察指标，具体见表1。

2.6 方法评价实验 通过重复性、重现性、稳定性及回收率实验等方法学验证实验，考察方法的准确度和稳定性。

表1 Box-Behnken设计因素水平及编码值

3 结果与讨论

3.1 最大吸收波长的确定 参照2.3的实验设计进行最大吸收波长的测定，结果表明，没食子酸标准品溶液和蒙香青兰总酚试液均在760nm波长处有最大吸收，所以选择检测波长为760nm。

3.2 单因素实验结果

3.2.1 水浴时间及温度对蒙香青兰总酚含量测定的影响 由图1(A)可知，25℃、35℃、40℃、45℃下，吸光度随水浴时间的延长而逐渐增大，无相对稳定时间；50℃、55℃下，从水浴时间30min开始，吸光度呈现相对稳定状态，且55℃时吸光度高于50℃吸光度。60℃下，吸光度随水浴时间的延长而逐渐降低，无相对稳定时间。因此，为方便实验测定及后续实验，选定水浴温度为55℃，水浴时间为30min。

3.2.2 福林试剂用量对蒙香青兰总酚含量测定的影响 由图1(B)可知，随着福林试剂体积的增加，吸光度值变化明显。当福林试剂体积为0.5mL，吸光度达到最大。因此，福林试剂体积选定为0.5mL。

3.2.3 碳酸钠试剂用量对蒙香青兰总酚含量测定的影响 由图1(C)可知，随着20%碳酸钠体积的增加，吸光度值呈现先逐渐增加后下降的趋势，在碳酸钠体积为0.9mL时，吸光度出现最大值。因此，20%碳酸钠体积选为0.9mL。

综上分析，单因素实验优化结果为：福林酚试剂体积0.5mL，碳酸钠溶液体积为0.9mL，且水浴时间30min，水浴温度55℃时，反应体系稳定且灵敏度较好。

3.3 响应面优化实验

3.3.1 实验设计及结果 按照2.5实验设计，本试验共含有17个试验，其中12个为析因实验，5个中心点重复实验。利用Design-Expert8.0.6软件对综合评分结果进行二次多元回归拟合，得到综合评分结果对A,B和C的二次多项回归模型方程为：Y=0.42+6.163*10-3A+0.055*B+4.075*10-3C+0.018AB+0.014AC-8.425*10-3BC-0.026A2-0.071B2-0.010C2。利用Design-Expert8.0.6软件，进一步对实验结果进行方差分析。

回归方程中各变量对指标响应值影响的显著性，由F检验来判断，概率P值越小，相应的变量显著程度就越高。由方差分析结果可知，此模型P值<0.01，表明本实验模型拟合极显著，可用来响应值预测；失拟项F值为1.07，P=0.4546>0.05，不显著，说明实测值与预测值之间无失拟存在,实验误差小，本实验无其他显著性因素的影响，因此模型成立，可以用于指导实验。由F值大小可推断，在所选择的试验范围内，3个因素对响应值的影响顺序为B>A>C，其中B因素(碳酸钠体积)P<0.01，表明B因素极显著，具有统计学意义。A、C因素对响应值影响不大。A2、B2项对响应值极显著(P<0.01)，AB项影响显著(0.01

3.3.2 二次拟合响应面分析 绘制响应面3D曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，可以直观反映出各因素及其交互作用对响应值的影响，如图2所示。

从响应曲面图可以看出，每个曲面都存在最高点。图中可以看出当福林体积为0.60mL左右，碳酸钠体积为1.20mL左右温度在54～58℃范围内，响应面趋于顶点位置，吸光度的值最高。图2(A)显示，吸光度随福林体积的增加呈现先增后减的趋势，随碳酸钠体积的增加先快速上升后缓慢下降，与方差分析结果相同，且碳酸钠体积对吸光度的影响较为显著。图2(B)显示，吸光度值随福林体积的增加呈现先增后减的趋势，随温度的增加有不明显的先增后减的趋势，福林体积对吸光度值的影响较为显著。图2(C)显示，吸光度值随碳酸钠体积的增加呈现先快速上升后缓慢下降的趋势，随温度的增加先缓慢增加，后逐渐趋于平缓的趋势，二者交互作用较为显著，碳酸钠体积对吸光度的影响较为显著。由此可知，3个因素对响应值的影响顺序为碳酸钠体积>福林体积>温度，与方差分析结果显示相同。

图2

3.3.3 验证实验 根据软件分析所得的结果，得到蒙香青兰总酚含量的最优检测条件为：福林试剂体积为0.62mL，20%碳酸钠溶液体积1.22mL，水浴温度55℃，在该条件下，吸光度的预测值为0.4309，该优化检测条件与响应曲面图结果吻合。考虑实验的可行性，对所得结果进行优化和验证实验。在福林试剂体积为0.60mL，20%碳酸钠溶液体积1.20mL，水浴温度为55℃的条件下，进行5次平行实验，所测得的吸光度平均值为0.4254，相对标准偏差为0.20%，与预测值的相对误差为1.28%，说明该模型具有

很好的预测性，且结果稳定可靠。

3.4 测定方法评价

3.4.1 线性关系考察 准确配制不同浓度的没食子酸溶液及不同浓度的蒙香青兰提取物溶液，按照上述优化结果分别测量吸光度值，得到线性回归方程分别为：Y=173.12X-0.1449(R2=0.9978)，Y=0.1001X+0.0912(R2=0.9943)。结果表明没食子酸及样品溶液浓度分别在0.2-1.0mg/mL及1.0-3.0mg/mL与吸光度线性关系良好。

3.4.2 重复性考察 按已确定的最适条件，准确量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2个浓度，体积为0.05mL的蒙香青兰总酚试液各1份，由同一分析人员在760nm波长处平行测定5次吸光度，结果得：1.0mg/mL时吸光度平均值为0.1892，SD为0.000245，RSD为0.13%。3.0mg/mL时吸光度平均值为0.6036，SD为0.000316，RSD为0.05%。表明该方法重复性良好。

3.4.3 重现性考察 按已确定的最适条件，准确量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2个浓度，体积为0.05mL的蒙香青兰总酚试液各1份，由不同实验仪器，不同分析人员在760nm波长处平行测定5次吸光度，结果得：1.0mg/mL时吸光度平均值为0.196，SD为0.000866，RSD为0.44%。3.0mg/mL时吸光度平均值为0.611，SD为0.000707，RSD为0.12%。表明该方法重现性良好。

3.4.4 稳定性考察 按已确定的最适条件，准确量取高(3.0mg/mL)、低(1.0mg/mL)2个浓度，体积为0.05mL的蒙香青兰总酚试液各1份，从30min开始，每隔10min在760nm波长处测定吸光度，连续测定3次。结果得：1.0mg/mL时吸光度平均值为0.2030，SD为0.006756，RSD为3.33%。3.0mg/mL时吸光度平均值为0.5894，SD为0.002946，RSD为0.50%。表明低浓度样品在50min内稳定性较差，高浓度样品在50min内稳定性较好。

3.4.5 加标回收率测定 准确量取5份浓度为1.0mg/mL蒙香青兰总酚提取液0.05mL，分别加入没食子酸0.0250mg，按以上实验确定的最适条件，测定5份样品的吸光度并计算混合后的总酚含量。计算回收率及相对标准偏差，结果见表2。

由表2可知，测定5份样品的标准偏差为1.04%，相对标准偏差为1.06%，回收率为97.70%，表明该方法相对可靠，可以用于蒙香青兰总酚含量的测定。

表2 没食子酸加样回收率实验

4 结论

通过优化实验和方法评价实验得出，香青兰总酚含量的最优检测条件为：取适量蒙香青兰总酚提取物，加入3.95mL去离子水漩涡混匀后，再加入0.6mL福林酚试剂，漩涡混匀并避光静置5min。之后加入20%碳酸钠1.2mL，漩涡混匀后加去离子水定容至10mL，摇匀，于55℃恒温水浴箱中避光反应30min，在760nm波长测吸光度。该方法操作较为简便快捷，设备要求低，重复性及重现性良好，50min内检测稳定性高，回收率为97.70%，可用于测定蒙香青兰植物中总酚含量。