蒙药嘎日迪-13味丸最佳提取工艺的优选

乌仁图雅 杨乌日娜 赵萨茹拉 贺喜格达来

(鄂尔多斯市蒙医医院，内蒙古 鄂尔多斯 017010)

嘎日迪-13味丸(扎冲-13味丸)是蒙医常用药,由诃子、草乌、石菖蒲、木香、麝香、珊瑚、珍珠、丁香、肉豆蔻、沉香、禹粮土、磁石、甘草等13味单药组成[1],出自《至高要方》古籍。现收载于《卫生部药品标准(蒙药分册)》[2]，在《中国医学百科全书》《蒙药方剂学》(统编教材)[3]均有记载。主要功能是祛风通窍，舒筋活血，镇静安神，除“协日乌素”;主治半身不遂，左瘫右痪，口眼歪邪，四肢麻木，腰腿不利，言语不清，筋骨疼痛，神经麻痹，风湿，关节疼痛。实验研究表明，具有抗血栓、抗真菌抗炎[4]、清除自由基[5]、脑缺血损伤保护作用[6-8]。临床研究表明，嘎日迪 -13 治疗糖尿病周围神经病变[9]、脑埂塞[10]、腰椎间盘突出症[11]等疗效确切，未见嘎日迪 -13 抗真菌感染相关的报道。

白色念珠菌又名白色假丝酵母菌,是一种人类和动物共患的深部条件致病性酵母菌,该菌可引起人的黏膜、皮肤、消化道、呼吸及神经系统等感染,引起白色念珠菌病(简称念珠菌病)。随着免疫抑制剂、抗生素及侵入性治疗方法的广泛应用,免疫低下患者数量逐年增加,真菌感染日渐增多,危及生命的深部真菌感染已成为医院监测和研究的重点[12]。白色念珠菌是目前深部真菌感染中最常见、最主要的病原体之一,深部白色念珠菌感染的病死率高达68.90%[13]。

本试验在综合文献资料的基础上，考虑乙醇提取浓度、料液比、提取次数、提取时间等多种影响因素，采用正交设计试验以浸膏得率及抑制白色念珠菌生长的最低药物浓度(MIC90)值为指标，对嘎日迪-13味丸提取工艺条件进行优选。

1 材料与方法

1.1 蒙成药 嘎日迪-13丸(内蒙古鄂尔多斯市蒙医研究所制，批号20170524)。

1.2 菌株及培养基 白色念珠球菌 (candida albicans)(菌种编号98001)由中国食品药品检定研究院购买。RPMI1640 sigma R8755-10×1L、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)。

1.3 主要仪器和试剂 96孔细胞培养板(NUNC163320)、血细胞计数板、生物安全柜(BSC1500ⅡA2-X型山东博讯)、BSP250型生化培养箱(山东博讯)、旋转蒸发仪、干燥箱、中药粉碎机、二甲亚砜(DMSO)、无水乙醇、蒸馏水。

1.4 有效成分提取工艺的正交试验设计 以料液比(A)、提取次数(B)、提取时间/次(C)及溶媒浓度(D)为考察对象，并根据单因素实验依据，拟定各因素的3水平(表1)，以提取物有效成分的得率、浸膏MIC值为综合考察指标，选用 L9(34)正交试验表进行实验，从而筛选出最佳的提取工艺条件。

按规定量称取药物9份，每份约10g ，分别粉碎并编号1～9 ；精确称量9份药物粉末，于溶媒中加热回流提取，合并滤液并浓缩滤液至糊状，放入105℃烘箱中3h ，直至烘干到恒重浸膏状态，测质量并计算得率，封存备用，分别重复3次。见表1。

表1 嘎日迪-13提取工艺主要因素

1.5 正交试验蒙药有效成分的体外抑菌活性试验

1.5.1 菌悬液的制备 制备RPMI1640液体培养基和 PDA培养基，并于4℃冰箱保存备用。取试验所用白色念珠菌菌种接种至PDA平板，28℃培养1周，活化2次，使菌落均匀覆盖PDA平板。用接种针挑取菌落于适量生理盐水，并用吸管吹打菌落，使菌游离于生理盐水中。经血细胞计数板计数。

1.5.2 药液的制备 精确称取各正交试验的提取物浸膏溶于10% DMSO中，配制成浸膏质量浓度为64mg/mL的溶液备用。临用前将药液用RPMI1640培养液按倍比稀释法稀释至工作浓度，提取物的工作浓度为32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06.0.03 mg/mL。

1.5.3 药敏试验方法 无菌96孔平底板(U型)微量板用紫外灯照射30min后，在每一排1～10孔内分别加入药物工作浓度100μL ，然后再加入上述制备的真菌菌液100μL，第11孔为阴性对照(只含RPMI1640培养液100 μL 和药物100 μL ，不含菌液)，12孔为阳性对照(只含培养液100 μL和菌液100 μL ，不含药物)。置于微量振荡板上振荡5min ，使各种液体充分混匀，35℃培养48h ，MIC90(最低抑菌浓度)值的判读：将药敏板每孔生长情况与阳性及阴性对照管相比较，以肉眼观察10%培养物生长的最低药物浓度孔作为观察终点，其浓度为 MIC90值。

2 结果

按照正交试验设计的提取方法进行嘎日迪-13有效成分的提取，得到9份嘎日迪-13有效提取物。通过对提取得到的各浸膏得率的计算及浸膏物质对白色念珠菌 MIC90值的研究分析，得出每个正交水平的有效部位得率及其对白色念珠菌MIC90值，分别计算各组试验结果的综合平均值 K1、 K11、K2 、K21和 K3、K31，极差 R1、R2，结果见表2。4个因素对嘎日迪-13提取物得率的影响大小顺序为： B>D>A>C ，以得率为指标的最优水平组合为 B3D1A3C2，即20倍量50%乙醇溶液，加热回流提取3次，每次 60min；4个因素对嘎日迪-13提取物 MIC90的影响大小顺序为：D>A=B>C，以 MIC90为指标的结果为D2A1B2C2、D1A2B2C3、D2A2B3C1、D2A3B1C3、D3A3B2C1、D1A3B3C2等6组同样显示最佳抑菌效果。综上所述，嘎日迪-13的最佳提取工艺为20倍量50%乙醇溶液，加热回流提取3次，每次 60min 。见表2。

表2 嘎日迪-13最佳提取工艺直观分析

3 小结

嘎日迪-13是从蒙药方吉朱木道尔吉、嘎日迪-5、巴特尔-7、洪古日-12等"杀粘"蒙药中筛选出抗白色念珠菌作用最强的处方。本试验表明，筛选出的嘎日迪-13提取工艺具有抑制白色念珠菌的作用，MIC90为2mg/mL。