血管紧张素转换酶基因多态性与强直性脊柱炎的相关性研究

刘治桓 王忻 吴浩华 常宝生

强直性脊柱炎 ( ankylosing spondylitis，AS ) 是一种血清类风湿因子阴性的慢性炎症性自身免疫性疾病，以骶髂关节和脊柱附着点炎症为主要病理改变，并常可累及眼、肺、肌肉等关节外组织，是最常见的脊柱关节病之一[1-2]。AS 发病的具体机制尚不明确，可能由遗传、感染及自身免疫功能异常等多因素共同作用所致，目前多数研究一致认为基因遗传因素是 AS 发病最主要的原因，对 AS发病的贡献可能超过 90%[2-4]。血管紧张素转换酶( angiotensin-converting enzyme，ACE ) 是肾素－血管紧张素系统 ( renin-angiotensin system，RAS ) 的重要组成成分，并可通过刺激细胞因子生成参与机体炎症调节过程。ACE 基因插入 ( insertion，I ) / 缺失( deletion，D ) 多态性位点是目前关于 ACE 基因开展研究最多的位点之一，可直接调节血清 ACE 生成及活性，已有研究发现系统性红斑狼疮及甲状腺自身免疫性疾病等多种自身免疫疾病与 ACE 基因 I / D 多态性相关[5-7]。基于上述研究证据，笔者认为有理由推测 ACE 基因 I / D 多态性可能与 AS 发病及进展相关。本研究以我国陕西汉族人群为研究对象，观察ACE 基因 I / D 多态性与 AS 的相关性，为临床工作提供参考。

资料与方法

一、纳入与排除标准

1. 纳入标准：( 1 ) AS 诊断参照 1984 年美国风湿病协会修订的 AS 诊断标准[8]；( 2 ) HLA-B27 阳性；( 3 ) 陕西地区汉族人，彼此无血缘关系；( 4 ) 随访资料完整。

2. 排除标准：( 1 ) 合并其它自身免疫性疾病；( 2 ) 合并严重肝脏、肾脏疾病，重度感染；( 3 ) 合并恶性肿瘤和血液性疾病；( 4 ) 妊娠期女性。

二、一般资料

连续性选择 2015 年 1 月至 2017 年 1 月于我科住院治疗的 144 例 AS 患者纳入 AS 组，其中男 92 例，女 52 例，平均年龄 ( 43.8±8.9 ) 岁。另外，从同期在我科治疗的非 AS 患者中随机选择 160 名作为对照组，满足 HLA-B27 阴性，其中男 104 名，女 56 名，平均年龄 ( 42.5±10.2 ) 岁。本研究通过本院伦理委员会审核批准，所有入组成员均签署知情同意书。

三、方法

1. 临床资料收集：包括年龄、性别、病史等基本信息，以及骶髂关节 X 线片检查、眼科检查和相关实验室检验结果。

2. 基因组 DNA 提取：采集清晨空腹时外周静脉血用于实验室检查，部分样本采用 DNA 提取试剂盒 ( 天根生化科技有限公司，北京 ) 提取全血基因组DNA。

3. 基因多态性检测：采用聚合酶链反应技术检测 ACE 基因 I / D 多态性。PCR 反应体系 ( 25 μl ) 包括：10×Buffer 2.5 μl，上、下游引物各 1 μl ( 上游：5’-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’；下游：5’-GATGTGGCC ATCACATTCGTCAGAT-3’ )，dNTP混合物 2 μl，TaqDNA 聚合酶 0.25 μl，模板 DNA 1 μl，不足部分由灭菌蒸馏水补足。反应条件为95 ℃ 预变性 4 min，然后按照变性 95 ℃ 20 s、退火65 ℃ 30 s、延长 72 ℃ 50 s 的顺序循环 30 个周期，最后 72 ℃ 延长 3 min。最后取扩增产物进行电泳，紫外灯下观察并摄片。

四、统计学处理

采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析，AS 组与对照组患者年龄比较采用t检验，余计数资料结果均以构成百分比 ( % ) 表示，组间比较采用χ2检验。基因型分布采用 Hardy-Weinberg 平衡定律检验。采用比值比 ( odd ratio，OR) 及其 95% 可信区间( confidence interval，CI) 表示相对风险度。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组间基线资料比较

AS 组共纳入 144 例，其中男 92 例，女 52 例，平均年龄 ( 43.8±8.9 ) 岁；对照组共纳入 160 名，其中男 100 名，女 60 名，平均年龄 ( 42.5±10.2 )岁，两组患者性别、年龄差异均无统计学意义 (P＝0.802；P＝0.259 )。

二、Hardy-Weinberg 遗传平衡检验结果

如图 1，ACE 基因 I / D 多态性位点基因型包括II，ID 和 DD 三种，本研究两组基因型分布经检验均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡 (P＞0.05 )，具有群体代表性。

图 1 ACE 基因 I / D 多态性 PCR 结果 ( M：marker；1,5：II 基因型；2,4：ID 基因型；3：DD 基因型 )Fig.1 PCR results of ACE gene I / D polymorphism ( M: Marker;1,5: II genotype; 2,4: ID genotype; 3: DD genotype )

三、ACE 基因 I / D 多态性与 AS 易感性的关系

如表 1，AS 组与对照组比较，ACE 基因 I / D 多态性位点在和显性基因模型，隐性基因模型和等位基因模型下差异均有统计学意义 (P＜0.05 )。

四、ACE 基因 I / D 多态性与 AS 疾病进展的关系

如表 2，高骶髂关节炎 X 线分期 ( III 期＋IV 期 )患者与低分期 ( 0 期＋I 期＋II 期 ) 患者比较，ACE基因 I / D 多态性位点等位基因分布频率差异无统计学意义 (P＝0.092 )，合并眼部病变患者与无眼部病变患者比较，ACE 基因 I / D 多态性位点等位基因分布频率差异有统计学意义 (P＝0.001 )。

表 1 ACE 基因 I / D 多态性与 AS 易感性的关系Tab.1 Association between ACE gene polymorphism and AS susceptibility

表 2 ACE 基因 I / D 多态性与 AS 疾病进展的关系Tab.2 Association between ACE gene polymorphism and progression of AS

讨 论

基于最新全基因组关联研究结果显示基因遗传因素对 AS 发病的贡献超过 90%，AS 患者一级亲属AS 发病率为 8%，但二级亲属 AS 发病率不足 1%，对于 HLA-B27 阳性的一级亲属发病率为 12%，HLA-B27 阴性的一级亲属发病率也不足 1%[9]。长期以来 AS 的相关基因遗传学研究主要针对 HLA-B27，目前研究结果证实 HLA-B27 与 AS 发病密切相关，正常人群中 HLA-B27 阳性率仅约为 5%，其中 1% 左右可能发展为 AS，而在 AS 患者人群中HLA-B27 阳性率超过 90%[10]。然而，有研究指出HLA-B27 的总遗传度仅约为 20%～30%，提示 HLA基因以外，存在其它 AS 发病遗传易感性位点[11]。近年来相继有研究发现地中海热 ( mediterranean fever，MEFE ) 基因，CCR4-NOT 转录复合体亚基-3( CCR4-NOT transcription complex subunit 3，CNOT3 )基因及白细胞相关免疫球蛋白样受体-2 ( leukocyteassociated immunoglobulin-like receptor 2，LAIR2 ) 基因等也存在 AS 遗传易感位点[11]。

ACE 基因位于第 17 号染色体，全长 21 kb，包含 26 个外显子和 25 个内含子，第 16 个内含子中存在 1 个 287 bp 的 I / D 变异。近年来研究发现 ACE 基因 I / D 多态性与多种疾病易感性相关，其中包括系统性红斑狼疮，类风湿关节炎，甲状腺自身免疫病及溃疡性结肠炎等慢性炎症性自身免疫性疾病[5-7]。其具体机制目前尚不明确，可能在于 ACE 可通过刺激细胞因子生成参与机体炎症调节过程，而血清ACE 浓度及活性均受 ACE 基因 I / D 基因型影响，越来越多研究证实 ACE 基因 I / D 多态性与 ACE 生成及活性密切相关，DD 基因型人群血清 ACE 水平最高，ID 基因型次之，II 基因型最低[5]。另外，ACE基因还存在其它多个多态性位点被证实与疾病易感性相关，如 rs4309、rs4343 位点多态性可能与阿尔兹海默病易感性相关[12]。

Inanir 等[11]以中东地区人群为研究对象，发现ACE 基因 I / D 多态性与 AS 易感性密切相关。然而研究结果显示不同种族人群 ACE 基因 I / D 多态性分布频率差异较大，高加索人群中 D 等位基因频率可高达 60%，东亚人仅为 35% 左右[13]，因此有必要就不同种族、不同地区人群，分别观察 ACE 基因 I / D 多态性与 AS 易感性的相关性。李维等[13]以重庆地区汉族人群为研究对象，发现 AS 组和健康对照组 D 等位基因频率分别为 69.5% 和 38.9%；本研究结果与之基本相符，两组 D 等位基因频率分别为 66.3% 和 36.3%，差异有统计学意义，表明对于北方汉族人 ACE 基因 I / D 多态性与 AS 易感性密切相关。Hamersma 等[14]一项临床研究共纳入 384 例AS 患者，尝试观察环境因素和基因因素在 AS 疾病进展中的作用，结果显示基因因素对 AS 疾病进展的贡献超过 90%。本研究结果显示 ACE 基因 I / D 多态性与骶髂关节炎 X 线分期无显著相关性，高分期( III 期＋IV 期 ) 患者与低分期 ( 0 期＋I 期＋II 期 ) 比较，D 等位基因频率差异无统计学意义，笔者分析高分期和低分期患者 D 等位基因频率分别为 63.9%和 36.1%，但χ2检验结果两组差异无统计学意义，可能与本研究纳入样本量较少相关，期待后续大样本研究结果进一步验证。另外，眼部病变作为 AS 患者最常见的关节外病变，约有 25%～30% 患者可出现结膜炎，虹膜炎，眼色素层炎或葡萄膜炎，眼部病变与 AS 严重程度无明显关联，但如若处理不当可能导致患者青光眼，甚至失明，因此探讨基因遗传因素与 AS 患者合并眼部病变的关系具有重要意义。本研究结果显示合并眼部病变的 AS 患者 D 等位基因频率显著增高，提示 ACE 基因 I / D 多态性可能与AS 患者合并眼部病变密切相关。

综上所述，ACE 基因 I / D 多态性可能与 AS 易感性及疾病进展均密切相关。然而本研究也存在不足之处：首先，由于真实世界中 HLA-B27 阳性的正常健康人及 HLA-B27 阴性的 AS 患者均较少，本研究 AS 组纳入患者均为 HLA-B27 阳性，对照组纳入对象均为 HLA-B27 阴性，期待后续有研究纳入病例组及对照组完全为 HLA-B27 阳性或完全为 HLA-B27 阴性，减少 HLA-B27 对研究结果的影响；其次，ACE 基因包括等多个多态性位点，对于其它位点多态性与 AS 易感性的关系以及多个位点之间的相互关系尚不明确，也期待后续进一步研究；最后，本研究仅为单中心研究结果，共纳入 AS 患者144 例，样本量较少，期待后续多中心大样本研究结果加以验证。