藏药绿萝花彗星试验（SCGE）研究

陈 明，丁淑梅，朱子凤，刘 群

（1.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.西南民族大学校医院，四川 成都 610041）

藏药材绿萝花（Araceae），为天南星科喜林芋属植物绿萝花的干燥花蕾，是一种具有民族特色的习用药材，多以晾干的花蕾泡水饮用，用于糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、脉管炎等慢性疾病的预防和治疗[1].目前对绿萝花的药效学研究多集中在降血糖[2-5]、降血脂[6]、抗氧化[7-9]及对机体免疫功能影响[10-11]等方面的研究，对其毒理学尤其是对遗传物的影响还末见研究报道.药物对于DNA损害越严重，细胞内产生的断裂片段越多，长度也越大.而研究藏药绿萝花对于遗传物质的影响最简单有效的检测方法就是彗星实验.彗星实验又称单细胞凝胶电泳技术 （SCGE），该技术是近年来兴起的一种简单，快速，准确，有效的细胞核DNA损伤检测技术.该技术通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系.本研究采用水萃取法制备绿萝花干膏制剂，根据遗传毒性研究试验中的单细胞凝胶电泳试验及其判定标准，研究不同剂量绿萝花对CHL细胞（中国仓鼠肺成纤维细胞系为研究对象）DNA的影响，现将研究结果报告如下.

1 材料

1.1 受试细胞及药物

受试细胞中国仓鼠肺成纤维细胞系（CHL），由上海细胞生物学研究所提供.

受试药物绿萝花干燥花蕾，由四川宇妥藏药药业有限责任公司提供，由西南大学园艺园林学院鉴定为天南星科喜林芋属植物藏药材绿萝花（Araceae），鉴定人:李先源.

1.2 主要试剂及仪器

细胞培养基 DMEM（AB216032，Hyclone）；丝裂霉素 C（MMC，MW33433，瑞氏罗氏有限公司）；环磷酰胺（CP，M0915A，大连美仑生物）.纤维素微孔滤膜（0.22 μM，Scapo33RB）；倒置显微镜 （OLYMPUS CX21，Tokyo Japan）；电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）；荧光显微镜（DM5000B，北京中显恒业仪器仪表有限公司）等.

2 方法

2.1 受试药物的制备

按照优化后的水提工艺[12]:浸泡0.5 h、20倍加水量、1 h煎煮时间、煎煮3次，制备绿萝花干膏制剂，干膏得率22.3%.参考韩金潭等[13]研究（绿萝花对成纤维细胞最大无毒浓度，TC0＝25%），换算成生药含量，DMEM配制成生药浓度为0.224 g/mL（5%）、0.448 g/mL（10%）、0.896 g/mL（20%）的绿萝花细胞受试液，经纤维素微孔滤膜（孔径0.22 μM）滤过，4℃冰箱保存备用.

2.2 彗星试验（单细胞凝胶电泳）

取对数增殖期的CHL细胞，调整密度为1×105/mL，随机分成3个受试药物剂量组、阳性药物组、3个受试药物剂量＋阳性药物组并设DMEM组；阳性药物为环磷酰胺（活化条件下，20 μg/mL）和丝裂霉素C（非活化条件下，0.25 μg/mL）.每组分别做 1 次、2次、3次染毒，4个重复.

彗星试验操作步骤参考Schnurstein A.等[14]研究并作适当改进；彗星图像观察参考Wu J等[15]研究.400倍荧光显微镜下观察单细胞电泳图像.每片随机计数25～50个细胞.每一个剂量组随机分析100个细胞.正常对照组具有完整的细胞核，DNA荧光图像为红色圆球形；阳性药物组可见明显彗星样拖尾现象.计算机CASP系统自动采集拖尾率（SCGE%、彗星率）、彗星头部 DNA率（HDNA%）、尾部 DNA率（TDNA%）、尾长（TL）、尾距（TM）等指标.SCGE%:拖尾率（彗星率），拖尾细胞个数和全部细胞个数的比值，反映 DNA损伤情况；HDNA%:头部荧光亮度/（头部荧光亮度＋尾部荧光亮度）×100%，反映DNA损伤情况；TDNA%:尾部荧光亮度/（头部荧光亮度＋尾部荧光亮度）×100% ，反映DNA损伤情况；TL:尾长是指细胞的DNA片段迁移长度，反映DNA断裂的程度；TM:尾长×尾部 DNA含量，反映DNA损伤情况.参考Kamer等[16]的损伤分级标准，将DNA损伤程度分为五级:

0级（无损伤细胞）:细胞核清楚、头部紧密、无彗星尾状现象；

1级（轻度损伤细胞）:胞核清楚、尾长不超过10 μm；

2级（中度损伤细胞）:胞核清楚、尾长在10～30 μm；

3级（高度损伤细胞）:尾长在30～40 μm；

4级（重度损伤细胞）:胞核与彗尾不能区分、尾长超过40 μm.

2.3 数据处理

3 结果与分析

3.1 CHL细胞彗星图像

0～4级CHL细胞DNA损伤彗星图像见图1.

图1 CHL细胞彗星图像（Gold view荧光染色，400×）Fig.1 The comet picture of CHL（Gold view staining，400 × ）注:图1-A为无损伤细胞；图1-B为轻度损伤细胞；图1-C为中度损伤细胞；图1-D为高度损伤细胞；图1-E为重度损伤细胞

图1 A显示，在碱性电解质作用下，荧光显微镜下的CHL细胞DNA发生解螺旋、断裂及片段释放出来（呈单链）；在Gold view荧光染色剂作用下呈红色荧光，且细胞核清楚、头部紧密、呈球形无彗星尾状现象，表明该细胞DNA未受到损伤.图1B显示，在显微镜下，CHL细胞DNA发生解螺旋、断裂及片段释放出来（呈单链）；荧光染色呈红色荧光，细胞DNA形态呈球形但边缘有些许拖尾，细胞的DNA受到了损伤，但细胞胞核清楚、尾长没有超过10 μm，为1级轻度损伤细胞.图1C显示，在显微镜下，CHL细胞DNA发生解螺旋、断裂及片段释放出来（呈单链）；呈红色荧光，细胞DNA形态呈球形但边缘有一定量的拖尾，胞核清楚、尾长在10～30 μm，细胞的DNA受到了中度损伤，为2级中度损伤细胞.图1D显示，显微镜下，CHL细胞DNA发生解螺旋、断裂及片段释放出来（呈单链）；呈红色荧光，细胞DNA形态呈球形但边缘有大量的拖尾现象，且尾长在30～40 μm，此细胞的DNA受到了高度的损伤，为3级高度损伤细胞.图1E显示，显微镜下，CHL细胞DNA发生解螺旋、断裂及片段释放出来（呈单链）；呈红色荧光，细胞DNA形态呈分散状有大量的拖尾现象，胞核与彗星的彗尾不能区分且尾长超过40 μm，为4级重度损伤细胞.

3.2 CHL细胞彗星图像检测指标

3.2.1 活化条件下CHL细胞彗星图像检测指标

活化条件下CHL细胞彗星图像检测指标结果见表1、表2.

表1 加S9彗星试验结果组间比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 1 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 between groups（%，μm，±sE，n＝4）

表1 加S9彗星试验结果组间比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 1 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 between groups（%，μm，±sE，n＝4）

组别 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL CP DMEM 0.224g/mL＋CP 0.448g/mL＋CP 0.896g/mL＋CP SCGE%1 4.7±1.1a 5.9±1.5a 7.2±2.7a 95.4±0.5b 4.2±0.5a 92.6±1.0b 88.4±0.8b 93.2±0.9b SCGE%2 5.5±0.7a 6.4±2.1a 5.5±1.9a 97.6±0.6b 5.1±0.2a 93.4±2.2b 91.5±1.7b 95.3±1.1b SCGE%3 7.1±1.5a 4.2±2.8a 6.7±2.4a 98.1±1.3b 3.7±0.2a 89.7±2.1b 85.3±1.6b 93.4±2.1b HDNA%1 93.7±3.1a 86.7±4.1a 91.3±3.0a 27.6±0.7b 97.5±3.9a 30.0±1.9b 33.7±2.4b 31.2±0.7b

注:同行右肩有相同小写字母的数据表示无显著差异，P＞0.05；同行右肩无相同小写字母有相同大写字母的数据表示有显著差异，0.01＜P＜0.05；同行右肩无相同字母的数据表示有极显著差异，P＜0.01.

表2 加S9彗星试验结果组内比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 2 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 within groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

表2 加S9彗星试验结果组内比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 2 Comparison of SCGE of Scindepus aureus with S9 within groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

注:同列相同指标右肩有相同小写字母的数据表示无显著差异，P＞0.05；同列右肩无相同小写字母有相同大写字母的数据表示有显著差异，0.01＜P＜0.05；同列右肩无相同字母的数据表示有极显著差异，P＜0.01.

组别 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL CP DMEM 0.224g/mL＋CP 0.448g/mL＋CP 0.896g/mL＋CP SCGE%1 4.7±1.1a 5.9±1.5a 7.2±2.7a 95.4±0.5b 4.2±0.5a 92.6±1.0b 88.4±0.8b 93.2±0.9b SCGE%2 5.5±0.7a 6.4±2.1a 5.5±1.9a 97.6±0.6b 5.1±0.2a 93.4±2.2b 91.5±1.7b 95.3±1.1b SCGE%3 7.1±1.5a 4.2±2.8a 6.7±2.4a 98.1±1.3b 3.7±0.2a 89.7±2.1b 85.3±1.6b 93.4±2.1b HDNA%1 93.7±3.1a 86.7±4.1a 91.3±3.0a 27.6±0.7b 97.5±3.9a 30.0±1.9b 33.7±2.4b 31.2±0.7b HDNA%2 92.8±1.4a 92.3±1.6a 88.8±1.1a 28.3±0.8b 98.3±2.5a 26.2±2.2b 35.5±1.1b 28.6±1.3b HDNA%3 95.2±2.1a 90.5±0.9a 85.9±2.1a 27.4±0.5b 98.3±1.9a 28.3±1.7b 30.8±3.3b 30.7±1.6b TDNA%1 1.4±0.3a 3.5±1.1a 4.7±2.1a 78.3±2.2b 1.3±0.4a 74.2±2.1b 73.2±3.9b 75.8±3.1b TDNA%2 1.8±0.8a 4.2±1.7a 4.7±1.8a 83.5±2.6b 0.9±2.1a 82.1±1.5b 65.5±2.5b 76.1±1.1b TDNA%3 2.3±0.1a 3.6±1.2a 4.2±1.4a 85.6±1.7b 1.5±0.3a 79.2±0.9b 67.3±2.5b 81.5±1.5b TL1（μm） 4.0±0.8a 6.6±3.0a 10.8±2.3a 73.5±2.1b 3.3±0.4a 74.2±2.1b 69.2±1.5b 72.8±3.7b TL2（μm） 3.7±0.3a 8.5±1.4a 16.8±2.8a 81.2±1.3b 2.8±0.3a 81.5±1.3b 69.5±0.6b 77.6±1.1b TL3（μm） 4.8±1.3a 9.1±1.6a 17.4±1.3a 82.2±2.4b 2.9±0.4a 78.2±1.6b 70.1±1.4b 78.4±2.3b TM1（μm） 0.05±0.02a 0.23±0.08a 0.50±0.07a 55.55±2.17b 0.04±0.01a 55.05±3.62b 50.65±4.46b 55.18±5.43b TM2（μm） 0.06±0.02a 0.31±0.01a 0.78±0.05a 67.80±3.04b 0.02±0.02a 66.17±2.86b 45.52±3.25b 59.06±3.36b TM3（μm） 0.11±0.02a 0.25±0.05a 0.73±0.03a 70.36±3.28b 0.04±001a 43.59±1.96b 52.62±2.48b 63.89±2.96b

表1显示，加入活化剂S9，细胞分别接毒一、二、三次，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL 绿萝花组的拖尾率（SCGE%）、头部DNA率（HDNA%）、尾部DNA率（TDNA%）、尾长（TL）及尾距（TM）和 DMEM组均无统计学意义（P＞0.05），但与环磷酰胺组比较有极显著差异（P＜0.01），说明环磷酰胺具有很强的致CHL细胞DNA损伤的作用，表现为SCGE%升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和TM均增加（均超过40 μm），而绿萝花在最大无毒浓度下（细胞毒性浓度）的三个剂量对CHL细胞DNA无影响；0.224 g/mL绿萝花 ＋CP组、0.448 g/mL绿萝花 ＋CP组和0.896 g/mL绿萝花＋CP组的SCGE%、HDNA%、TD-NA%、TL和TM与DMEM组比较有极显著差异（P＜0.01），并与环磷酰胺组相当（P＞0.05）.表2显示，各组染毒一、二、三次，CHL细胞彗星指标均无统计学意义（P＞0.05）.

试验结果表明，加入S9，环磷酰胺可引起CHL细胞DNA损伤，表现为 SCGE%升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和 TM 均增加，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL绿萝花对CHL细胞DNA既无损伤也无损伤保护作用.

3.2.2 非活化条件下CHL细胞彗星图像检测指标

非活化条件下CHL细胞彗星图像检测指标结果见表3、表4.

表3 不加S9彗星试验结果组间比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 3 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 between groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

表3 不加S9彗星试验结果组间比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 3 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 between groups（%，μm，X ±SE，n＝4）

注:同表1.

组别 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL MMC DMEM 0.224g/mL＋MMC 0.448g/mL＋MMC 0.896g/mL＋MMC SCGE%1 2.8±0.8a 7.2±1.6a 7.3±1.1a 90.8±0.2b 4.7.±0.1a 94.1±0.6b 92.5±0.4b 92.8±0.1b SCGE%2 5.8±0.6a 8.3±1.5a 5.9±1.9a 95.5±1.3b 3.3±0.4a 93.7±0.8b 95.3±1.3b 92.4±1.6b SCGE%3 8.3±1.2a 6.1±3.7a 9.5±1.8a 98.1±1.6b 3.9±0.2a 93.2±2.4b 83.5±2.6b 92.6±1.7b HDNA%1 93.5±2.1a 88.2±2.6a 96.9±3.1a 30.5±0.3b 98.1±2.7a 32.8±1.4b 27.6±1.8b 32.8±1.2b HDNA%2 89.7±0.9a 91.9±0.8a 90.2±2.1a 32.2±0.2b 97.3±2.2a 30.1±1.7b 25.4±1.2b 33.6±0.9b HDNA%3 93.8±1.1a 90.7±1.6a 95.9±0.5a 30.8±0.4b 95.2±1.5a 32.5±2.2b 7.8±1.3b 34.7±1.1b TDNA%1 2.3±1.2a 4.2±0.6a 6.8±1.6a 79.5±1.2b 1.7±1.6a 78.6±1.6b 67.8±1.9b 83.2±1.1b TDNA%2 0.7±0.2a 5.9±1.4a 8.4±1.4a 91.7±2.1b 2.8±1.3a 88.4±2.2b 71.4±2.5b 81.9±0.7b TDNA%3 2.2±0.2a 7.3±1.1a 7.5±1.4a 87.2±1.1b 1.7±0.4a 78.3±1.1b 76.5±3.3b 85.0±2.8b TL1（μm） 5.6±0.7a 12.1±3.0a 16.5±2.3a 78.8±3.3b 5.1±0.1a 66.3±1.8b 71.6±2.1b 88.8±1.5b TL2（μm） 7.3±1.0a 15.5±1.4a 16.2±1.8a 69.7±2，7b 6.8±0.6a 84.8±2.1b 68.3±1.9b 67.4±2.2b TL3（μm） 8.5±1.2a 17.1±1.6a 17.1±1.6a 88.5±1.4b 6.9±0.2a 89.5±0.7b 78.2±2.3b 88.4±1.3b TM1（μm） 0.12±0.01a0.50±0.07a1.12±0.02a62.64±2.06b0.08±0.07a 52.11±2.18b 48.54±4.48b 73.88±5.43b TM2（μm） 0.51±0.01a0.91±0.05a1.36±0.08a63.91±4.09b0.19±0.04a 74.96±2.32b 48.76±2.62b 55.20±2.26b TM3（μm） 0.18±0.07a 1.24±0.08 1，28±0.02a77.17±2.22b0.11±0.07a 70.07±2.85b 59.82±2.33b 78.49±2.92b

表4 不加S9彗星试验结果组内比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 4 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 within groups（%，μm，±sE，n＝4）

表4 不加S9彗星试验结果组内比较（%，μm，±sE，n＝4）Table 4 Comparison of SCGE of Scindepus aureus without S9 within groups（%，μm，±sE，n＝4）

组别 0.224g/mL 0.448g/mL 0.896g/mL MMC DMEM 0.224g/mL＋MMC 0.448g/mL＋MMC 0.896g/mL＋MMC SCGE%1 2.8±0.8a 7.2±1.6a 7.3±1.1a 90.8±0.2b 4.7.±0.1a 94.1±0.6b 92.5±0.4b 92.8±0.1b SCGE%2 5.8±0.6a 8.3±1.5a 5.9±1.9a 95.5±1.3b 3.3±0.4a 93.7±0.8b 95.3±1.3b 92.4±1.6b SCGE%3 8.3±1.2a 6.1±3.7a 9.5±1.8a 98.1±1.6b 3.9±0.2a 93.2±2.4b 83.5±2.6b 92.6±1.7b HDNA%1 93.5±2.1a 88.2±2.6a 96.9±3.1a 30.5±0.3b 98.1±2.7a 32.8±1.4b 27.6±1.8b 32.8±1.2b HDNA%2 89.7±0.9a 91.9±0.8a 90.2±2.1a 32.2±0.2b 97.3±2.2a 30.1±1.7b 25.4±1.2b 33.6±0.9b HDNA%3 93.8±1.1a 90.7±1.6a 95.9±0.5a 30.8±0.4b 95.2±1.5a 32.5±2.2b 27.8±1.3b 34.7±1.1b TDNA%1 2.3±1.2a 4.2±0.6a 6.8±1.6a 79.5±1.2b 1.7±1.6a 78.6±1.6b 67.8±1.9b 83.2±1.1b TDNA%2 0.7±0.2a 5.9±1.4a 8.4±1.4a 91.7±2.1b 2.8±1.3a 88.4±2.2b 71.4±2.5b 81.9±0.7b TDNA%3 2.2±0.2a 7.3±1.1a 7.5±1.4a 87.2±1.1b 1.7±0.4a 78.3±1.1b 76.5±3.3b 85.0±2.8b TL1（μm） 5.6±0.7a 12.1±3.0a 16.5±2.3a 78.8±3.3b 5.1±0.1a 66.3±1.8b 71.6±2.1b 88.8±1.5b TL2（μm） 7.3±1.0a 15.5±1.4a 16.2±1.8a 69.7±2，7b 6.8±0.6a 84.8±2.1b 68.3±1.9b 67.4±2.2b TL3（μm） 8.5±1.2a 17.1±1.6a 17.1±1.6a 88.5±1.4b 6.9±0.2a 89.5±0.7b 78.2±2.3b 88.4±1.3b

注:同表2.

表3显示，在没有加入S9活化剂情况下，分别接毒一、二、三次，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL绿萝花组的拖尾率（SCGE%）、头部 DNA率（HDNA%）、尾部 DNA 率（TDNA%）、尾长（TL）和尾距（TM）和DMEM组均无统计学意义（P＞0.05），与丝裂霉素C组比较差异极显著（P＜0.01），说明丝裂霉素C（MMC）具有很强的致CHL细胞DNA损伤的作用，表现为SCGE% 升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和 TM 均增加（均超过40 μm）；0.224 g/mL绿萝花 ＋MMC组、0.448 g/mL绿萝花 ＋MMC组和0.896 g/mL绿萝花＋MMC组的SCGE%、HDNA%、TDNA%、TL和TM与DMEM组比较有极显著差异（P＜0.01），并与MMC 组相当（P ＞0.05）.表4显示，各组染毒一、二、三次，CHL细胞彗星指标均无统计学意义（P＞0.05）.

试验结果表明，在不加S9，丝裂霉素C可引起CHL细胞DNA损伤，表现为SCGE%升高、HDNA%下降、TDNA%升高，TL和 TM均增加，0.224 g/mL、0.448 g/mL、0.896 g/mL绿萝花对CHL细胞DNA既无损伤也无损伤保护作用.

4 讨论和结论

细胞核DNA为负超螺旋结构，一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股螺旋结构连续性影响不大，而且不易释放出来，但DNA残留会形成类核，如果类核中的DNA有断裂，断裂点引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外就会形成一个DNA晕圈，在电场中，DNA断片可向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，通过测量彗星尾部的长度、面积和荧光强度等指标可以对DNA损伤程度进行定量分析.单细胞凝胶电泳检测（Single cell e-lectrophoresis assay，SCGE）的依据是受试细胞在致突变剂的作用下，经过裂解解旋中和染色后包埋在琼脂糖里的细胞内DNA脱离而出从而会产生形似彗星的图像，通过检测尾部的长度和DNA含量来判断待测药物是否具有致突变性和抗突变性，与DNA电泳梯度法、TUNUL法等相比，具有操作简单、试验时间短等优点.且该技术既可用于活细胞，也可用于死亡细胞DNA的分析[17～20].本研究以CHL细胞为研究对象，以拖尾率（SCGE%）、头部 DNA率（HDNA%）、尾部 DNA 率（TDNA%）、尾长（TL）和尾距（TM）为考核指标，将CHL细胞分为正常对照组、不同剂量绿萝花并以环磷酰胺、丝裂霉素C为对照，在传统遗传毒理学研究基础上，采用多次染毒研究方法，研究绿萝花干膏制剂对细胞DNA的影响.研究结果表明:环磷酰胺和丝裂霉素C可引起CHL细胞大量拖尾、HDNA%下降、TDNA%上升，TL和TM均超过40μm；最大无毒浓庋下的三个剂量绿萝花对CHL细胞既无致突变作用也无致突变保护作用.

绿萝花为藏族地区珍贵药材，民间以泡茶习俗方式预防和治疗高血压、高血脂、糖尿病及各类血管炎症，目前对绿萝花的药理学研究主要集中在降血糖、降血脂、抗氧化及对机体免疫功能影响等方面，对其毒理学研究尤其是长期服用后对遗传物的影响还末见报道.本研究结果表明绿萝花体外对细胞染色体DNA结构无影响，为临床安全用药提供了科学依据.其对细胞染色体DNA的慢性及亚慢性毒理作用还有待进一步研究.