QuEChERS-气相色谱-质谱法同时测定香蕉酸奶中5种拟除虫菊酯类农药残留

杨会会，娄芳慧，韩二芳，古洋，钱志伟

（河南农业职业学院食品工程学院，郑州451450）

0 引 言

拟除虫菊酯类农药（Pyrethroid Pesticides）是一种高效低毒的杀虫剂，但是过量的使用仍然会导致哺乳类动物长期接触低剂量的残留菊酯。研究表明拟除虫菊酯类农药对神经系统、生殖系统和免疫系统等存在一定的毒性。因此，中国、日本和欧盟均对拟除虫菊酯类农药在谷物、食用菌、香蕉和乳制品等产品中的残留量做出了严格的规定。

香蕉酸奶是一种具有多种保健作用的功能性食品[1]，近年来出现大量关于香蕉酸奶制作工艺方面的研究[2-3]。但是目前拟除虫菊酯类农药残留的研究主要集中在果蔬[4～6]、茶叶[7]和药材[8]等方面，关于香蕉酸奶中拟除虫菊酯类农药残留的检测尚未见报道。

该实验采用Q uEChERS法对香蕉酸奶样品进行前处理，实现低耗高效的检测效果，为香蕉酸奶的安全监督提供便捷可靠的检测方法。

1 实验

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B-5977A气质联用色谱仪，湘仪台式高速冷冻离心机，漩涡振荡仪，超声波萃取仪，氮吹仪。

农药标准品（质量浓度100 m g/L）：联苯菊酯、甲氰菊酯、三氟氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯；正己烷、乙腈、丙酮、二氯甲烷（色谱纯试剂）；无水硫酸镁（分析纯）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基键合硅胶（C18）。

1.2 混合标准工作溶液配制

分别用微量注射器精确吸取200μL各拟除虫菊酯标准品至2 m L容量瓶中，用正己烷定容。则混合标准工作溶液中各组分的质量浓度均为10m g/L。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

（1）提取。称取4.0 g左右香蕉酸奶样品至离心管中，向其中加入10 m L乙腈。涡旋1 min后用超声波萃取仪提取20 min（超声功率比：30%；超声开/关：3.0 s/3.0 s），再向离心管中加入4 g无水硫酸镁，涡旋1 min。在4℃低温条件下以8 000 r/min离心5 min，将上清液转移至另外一洁净离心管中。向呈有酸奶样品的离心管中再次加入5 m L乙腈，涡旋振荡1 min，而后在4℃低温条件下以8 000 r/min离心5 min，取上清液。合并两次提取所得上清液。

（2）净化。向装有提取液的离心管中加入300m g无水 MgSO4，300 m g PSA和 100 m g C18；涡旋振荡2 min，在4℃低温条件下以转速为8 000 r/min离心5 min，取上清液至氮吹管中，在70℃的情况下氮吹至近干，而后用正己烷复溶至1.0m L，经0.22μm有机滤膜过滤至气相色谱进样瓶中，用GC-M S测定。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。Agilent HP-5色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），进样模式：不分流进样；进样口温度：250℃，进样量为1μL。程序升温：初始温度180℃，保持1 min，以25℃/min升温至240℃，保持2 min，以0.5℃/min升温至242℃，保持1 min，以8℃/min升温至260℃，保持8min，以10℃/min升温至280℃；后运行温度为285℃，运行3 min。载气：He，纯度≥99.999%。

（2）质谱条件。溶剂延迟时间为3 min；色谱-质谱传输线温度为280℃；离子源温度为230℃；离子化方式为EI；四级杆温度为150℃；电子能量为70 eV，测定方式为SIM，各组分定性及定量条件如表1所示。

表1 5种拟除虫菊酯农药的保留时间和特征离子

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

5种拟除虫菊酯类农药均属于带负电荷的弱极性物质，选用非极性或弱极性色谱柱更有利于目标化合物的分离。常用于分离拟除虫菊酯类农药的毛细管色谱柱为HP-5（非极性）和DB-1701（弱/中等极性），实验中所涉及的几种拟除虫菊酯类农药沸点相对比较高，其中氰戊菊酯和溴氰菊酯农药的沸点均为300℃。HP-5和DB-1701毛细管色谱柱的最高使用温度分别为350℃和300℃，为防止柱流失现象出现，实验过程中选择HP-5毛细管色谱柱对5种拟除虫菊酯农药进行分离。测定过程中经过多次反复实验，最终确定程序升温条件，标准物质色谱如图1所示。由图1可以看出，5种拟除虫菊酯类农药的色谱峰峰形尖锐且响应较好，能够实现目标化合物的有效分离。

图1 5种拟除虫菊酯类农药标准品气相色谱图

2.2 拟除虫菊酯提取条件优化

向空白样品中加入相同体积的拟除虫菊酯混合标准溶液，分别考察提取溶剂、提取次数和超声提取时间对测定结果的影响。

2.2.1 提取溶剂的选择

实验分别考察了正己烷、乙腈、丙酮和二氯甲烷对香蕉酸奶中5种拟除虫菊酯类农药的提取效果。四种有机溶剂作为提取试剂时加标回收率分别在62.9%～90.8%，84.2%～104.4%，71.9%～84.9%和73.17%～90.2%之间；具体结果如图2所示。香蕉酸奶本身富含脂肪，以丙酮和正己烷作为提取试剂时，溶剂将样品中的脂类也提取出来，导致干扰物质增加，并且丙酮作为提取试剂时回收率总体偏低。二氯甲烷对三氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的提取效果不太好，并且二氯甲烷本身毒性比较大，对实验操作人员的损害比较大。相比较而言，乙腈穿透力强，易渗入至细胞组织，更容易将5种拟除虫菊酯类农药从样品中提取出来，并且样品中油脂等杂质也不易被乙腈提取出来[9]，避免提取液中其他成分过多导致仪器受污染。因此该实验最终选择乙腈作为提取试剂。

图2 提取试剂对5种拟除虫菊酯类农药回收率的影响

2.2.2 提取次数的选择

提取次数可能对拟除虫菊酯类农药的回收率产生比较大的影响。在超声功率比为30%，超声开3.0 s而后关3.0 s的条件下，实验依次考察了使用乙腈对酸奶中拟除虫菊酯类农药提取1～4次时目标物质的回收率，具体操作为：第一次提取时向加标样品中加入10m L乙腈和4 g无水硫酸镁，涡旋1 min+超声萃取20 min，离心后取上清液；第二次提取时向首次提取后的样品中加入5m L乙腈，涡旋1min，离心取上清液；第三、四次提取方法与第二次提取相同，合并上清液。对四分空白加标样品分别进行提取1～4次操作，考察其回收率，结果如图3所示。由图3可以看出，仅提取1次时5种拟除虫菊酯类农药的回收率总体偏低，在67.1%～83.3%之间；提取两次时目标物质的回收率在87.8%～101.6%之间，已经能够满足实验需求，随着提取次数增加各组分回收率提高的程度比较小，与此同时也会带来试剂用量大、操作时间延长、共提取杂质增多等不利因素，为后期提取液的净化和上机测定带来较大的干扰。因此实验最终选择用提取次数为两次。

图3 不同提取次数对5种拟除虫菊酯类农药回收率的影响

2.2.3 超声提取时间的选择

香蕉酸奶中的很多组分容易与拟除虫菊酯类农药结合，单纯以振荡或涡旋的形式很难彻底的实现酸奶中拟除虫菊酯农药的提取。因而，实验选用涡旋+超声萃取的形式提高5种拟除虫菊酯类农药的回收率。涡旋振荡1 min后将离心管置于超声萃取仪上，在超声功率比为30%、超声开3.0 s而后关3.0 s的条件下分别考察未超声、超声5，10，15，20 min和超声25 min处理后样品的测定情况，结果如图4所示。由图4可以看出，在0～20 min范围内，5种拟除虫菊酯农药的回收率总体成增长趋势，当提取时间为25min时甲氰菊酯和三氟氯氰菊酯的回收率反而降低。这可能是因为在0～20min内随着超声时间延长，样品中细胞破裂逐步完全，拟除虫菊酯类农药逐渐被释放出来；20 min后细胞破碎已经基本到达最大程度，持续的超声所产生的热效应反而可能会导致部分拟除虫菊酯类农药分解，造成其回收率降低。因此实验最终选择超声时间为20min。

2.3 净化条件优化

PSA（N-丙基乙二胺）是一种常用的吸附剂，能够有效的除去香蕉酸奶提取液中的金属离子、糖类、酚类、极性的脂肪酸和色素等杂质。C18（十八烷基键合硅胶）可以除去提取液中弱极性色素、维生素、脂类和固醇类。研究证明，PSA和C18同时添加时对于脂类的净化效果会更好[10]，实验选择PSA-C18混合试剂作为净化剂。与此同时，加入适量的无水M gSO4能够进一步降低提取液中水分质量分数，有助于提高净化效果。净化提取液过程中固定无水M gSO4加入量为300m g，依次优化PSA和C18的使用量。

图4 不同超声时间对5种拟除虫菊酯类农药回收率的影响

在空白加标条件下，分别比较了提取液中PSA加入量为100，150，200，250，300 m g和350 m g时5种拟除虫菊酯类农药的回收率，发现PSA加入量为300 m g时各组分回收率最高，在78.3%～90.2%之间，当PSA加入量为350m g时，各组分回收率并没有明显的提高。而后在PSA含量为300 m g的基础上，比较C18含量分别为0，50，100，150 m g和200 m g时的净化效果，发现当C18加入量为100 m g时回收率达到82.8%～97.5%（详细结果见图5），能够达到实验要求，C18加入量增加后各组分回收率并无明显提高，并且联苯菊酯和溴氰菊酯的回收率反而有所下降，可能是因为部分农药被C18吸附的缘故，为保证测定结果的准确性并节省实际用量，最终确定C18吸附的用量为100 m g。故实验选用300m g PSA和100mg C18混合试剂作为净化剂。

图5 吸附剂PSA(300mg)-C18(100mg)时5种拟除虫菊酯类农药的回收率

2.4 方法验证

2.4.1 方法的线性范围及检出限

为了避免基质效应对测定结果产生影响，实验中采用基质空白溶液作为溶剂稀释混合标准溶液，配制浓度为0.05，0.10，0.50，1.00，2.00，2.50 m g/L和3.00 m g/L的5种拟除虫菊酯标准系列，经GC-M S测定后，以化合物的峰面积（Y）对质量浓度（X）绘制标准曲线，获得各组分的回归方程及相关系数R2。以3倍信噪比计算各组分的检出限，结果见表2。5种拟除虫菊酯类农药质量浓度在0.05～3.00 m g/L之间呈现良好的线性关系，检出限在0.60～1.83μg/kg之间。

2.4.2 精密度与回收率

在香蕉酸奶中加入拟除虫菊酯混合标准溶液，使其提取净化后质量浓度分别为0.20，0.75 m g/L和1.00 m g/L，每个水平平行测定5次，结果如表3所示。

可以看出，各组分在三个不同加标浓度下回收率在82.5%～104.3%之间，相对标准偏差在3.1%～6.4%之间，能够满足测定要求。

表2 5种拟除虫菊酯类农药的线性方程及方法检出限

表3 5种拟除虫菊酯类农药的加标回收率及相对标准偏差

3 结束语

建立了QuEChERS-气相色谱-质谱技术对香蕉酸奶中5种拟除虫菊酯类农药的测定方法。分别从色谱工作条件、提取试剂、超声时间和净化试剂4各方面对实验条件进行优化，建立了香蕉酸奶中5种拟除虫菊酯类农药的测定方法。经验证该方法在低、中、高三个级别的加标情况下回收率和相对标准偏差均符合实验要求，能够满足样品测定需求。