UPLC-MS/MS法同时检测猪肉中磺胺类药物残留的不确定度

刘莉，虞冰，吾建祥，马婧妤，杨德毅，刁银军

(1.金华市农产品质量综合监督检测中心，浙江 金华 321017； 2.金华职业技术学院，浙江 金华 321007)

磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是一类抗菌作用高效且价格低廉的化学合成抗生素，广泛应用在生猪养殖过程中。SAs可在动物源性食品中残留和蓄积，进入人体后，可破坏造血系统，引起溶血性贫血[1-2]，而且SAs可导致病原体产生抗药性，导致机体发生过敏反应[3-6]，危害人体健康。欧盟及我国规定，磺胺类药物在肉类食品中最高残留限量为：单一磺胺类药物不超过25 μg·kg-1，磺胺类药物总量不超过100 μg·kg-1[7-8]。

随着人们对肉类食品质量安全意识的提高，检测机构对兽药残留检测的质量控制标准也更加规范，通过严格控制质量控制程序、提升实验室测试质控能力、增加实验室间的检测结果比对、溯源测量结果等措施增加测量结果的可靠性[9]。本文主要依据《畜禽肉中十六种磺胺类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》(GB/T 20759—2006)对猪肉中3种磺胺类药物残留(磺胺甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺多辛)进行检测，研究检测方法的不确定度的来源、评定、合成以及结果表示，通过建立测定猪肉中3种磺胺类药物残留方法的测量不确定度的模型，评定测量不确定度，使不确定度作为提高分析检测结果的精密度和准确性的理论依据[10-12]。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肉购自金华农贸市场。

LC-30A-LCMS-8050液相色谱仪串联质谱仪、ESI-8050离子源、Sil-30AC自动进样器(日本岛津公司)；均质机(德国IKA公司)；N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司)；YQ116-01电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。乙腈、正己烷、无水硫酸钠均为分析纯；磺胺甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺多辛标准品(天津思亿浩远科技有限公司)。

1.2 液相条件

色谱柱，岛津Shim-pack GISS C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)。流动相A，0.2%甲酸水溶液，B，乙腈/甲醇(6∶4)溶液，初始浓度为10%。0～4.5 min，B线性变化至40%；4.5～4.6 min，40% B线性变化至95%；4.6～5.5 min，95% B保持不变；5.5～5.6 min，95% B线性变化至10%；5.6～9 min，10% B保持不变。流动相流速为0.4 mL·min-1，柱温为40 ℃，进样量为1 μL。

1.3 质谱条件

离子源为电喷雾离子源，离子源温度300 ℃，扫描方式为正离子扫描，检测方式为多反应检测，电喷雾电压5 000 V，加热气为空气(10 L·min-1)，加热温度400 ℃，雾化气为氮气(3 L·min-1)，干燥气为氮气(10 L·min-1)，延迟时间3 ms，碰撞气为氩气(表1)。

表1 3种磺胺类药物的检测离子、对应质谱参数及保留时间

注：*为定量离子。

1.4 样品处理

称取5 g猪肉(精确至0.01 g)样品，放在50 mL离心管中，向离心管中加入20 mL乙腈和20 g无水硫酸钠后，均质1.5～2 min，3 000 r·min-1离心3 min，离心后的上清液倒入100 mL鸡心瓶中，滤渣加入20 mL乙腈重复上述操作1次，合并的上清液一并加到鸡心瓶中。向鸡心瓶中加入10 mL异丙醇，50 ℃水浴旋蒸干，准确加入1 mL流动相和1 mL正己烷溶解旋干物，溶解液转移至5 mL离心管中，1 min涡旋，3 000 r·min-1离心3 min，弃除上层，再加入1 mL正己烷，重复上述步骤1次。取下层清液，0.22 μm滤膜过滤后备用。

2 结果与分析

2.1 定量数学模型

2.2 不确定度的来源

猪肉中3种磺胺类药物残留测定不确定度来源主要包括2大类：磺胺类药物标准品称量、稀释等过程中引入的不确定度和猪肉中磺胺类药物在称量、样品进样、样品重复测定以及回收率等过程中引入的不确定度，计算合成不确定度(表2)。

2.2.1 标准品纯度引入的不确定度

表2 磺胺药物在猪肉中残留量测定的不确定度

2.2.2 标准物质称量引入的不确定度

2.2.3 标准物质定容引入的不确定度

2.2.4 标准溶液稀释引入的不确定度

2.2.5 标准溶液配制引入的不确定度

2.2.6 拟合标准曲线引入的不确定度

3种磺胺类药物标准系列溶液各取1 μL分别测定，根据UPLC-MS/MS方法测定得到相应的色谱峰面积Ai，用Excel拟合而成的线性回归方程为A=ac+b。式中，a为斜率，b为截距。磺胺甲嘧啶的标准曲线拟合回归方程为：Y=118 276X+6 743.4，R2=0.999 2；磺胺间甲氧嘧啶的标准曲线拟合回归方程为：Y=59 784.482 8X+5 907.422 4，R2=0.999 0；磺胺多辛的标准曲线拟合回归方程为：Y=97 845X+5 902.2，R2=0.999 9。3种磺胺类药物拟合标准曲线引入的不确定度为Urel(mc)。

2.2.7 猪肉样品称量引入的不确定度

2.2.8 进样体积引入的不确定度

2.2.9 样品重复检测引入的不确定度

2.2.10 回收率引入的不确定度

2.3 扩展不确定度

根据《化学分析测量不确定度评定》(JJF 1135—2005)，对于大多数测量采用包含因子(k=2)进行衡量，则猪肉中磺胺类药物残留量的扩展不确定度U=Urel×2×X，由此得到UPLC-MS/MS方法同时检测猪肉中3种磺胺类药物残留量的结果(表3)。

表3 猪肉中磺胺类药物残留量的扩展不确定度

2.4 影响不确定度因素的分析

采用UPLC-MS/MS方法同时检测猪肉中3种磺胺类药物残留，检测过程中引入的不确定度实验过程主要是加标回收率、样品重复测量、样品称量、拟合标准曲线、配制标准系列溶液、稀释标准溶液、标准物质定容、标准物质称量、标准品纯度(图1)。

图1 不确定度评定结果分析

影响检测的各个因素的不确定度范围在0.000 408～0.026 720，磺胺多辛、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲嘧啶的合成不确定度在测定结果的比重分别是6.4%、5.9%和5.4%。从图1可以看出，检测磺胺多辛时，样品重复检测对实验结果影响最大；检测磺胺间甲氧嘧啶时，拟合曲线产生的不确定度对实验结果影响最大；检测磺胺甲嘧啶时，拟合曲线产生的不确定度对实验结果影响最大。样品称量对3种药物残留实验影响最小。

3 小结

在对猪肉中3种磺胺类药物的分析检测操作过程中，可以通过提高实验操作人员的专业素质，增加平行样品测定次数，并定期对气相色谱仪进行检定，来减小分析测定结果的不确定度，保证检测结果的准确性。