超高效液相色谱-串联质谱法测定杨梅中嘧菌酯残留

王全胜，付岩，张亮，朱勇，赵健，吴银良

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315040)

嘧菌酯(Azoxystrobin)是新型高效、广谱、内吸性杀菌剂，对几乎所有真菌纲(子囊菌纲、担子菌纲、卵菌纲和半知菌类)病害，如白粉病、锈病、霜霉病、稻瘟病等均有良好的活性，其能够与细菌细胞内线粒体上细胞色素相结合，阻断细胞色谱b和细胞色素c1之间的电子传递，抑制能量合成，进而使细菌死亡[1]。目前，嘧菌酯在我国已登记用于水稻、黄瓜、马铃薯、葡萄、番茄等作物[2]，使用较广。

杨梅属于杨梅科杨梅属，于我国浙江、江西、云南、福建等地均有种植。杨梅果树病虫害较多，白腐病等细菌病害时有发生，严重影响其品质和产量[3]。而嘧菌酯因其广谱高效等优点可被用于杨梅上防治褐斑病等病害。因此，有必要对其使用后可能产生的残留风险进行评估，而快速高效的残留分析方法则不可或缺。本文拟基于QuEChERS方法，结合超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS)，建立一种用于检测杨梅中嘧菌酯残留量的分析方法，以期为有效监控杨梅中嘧菌酯残留风险提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试杨梅品种为东魁杨梅。

试验仪器由Waters Xevo TQ MS超高相液相色谱-串联质谱仪配Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；KS4000ic恒温振荡器(德国IKA公司)；3K15高速离心机(德国Sigma公司)；GENIUS3旋涡混合器(德国IKA公司)；万分之一电子天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；Milli-Q超纯水仪(美国millipore公司)。试剂有乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；PSA(40～60 μm，上海安谱公司)；无水硫酸镁及氯化钠(分析纯，中国国药集团)；嘧菌酯标准品(100 μg·mL-1，农业部环境保护科研监测所)。

1.2 样品前处理

1.2.1 提取

称取样品5 g(精确至0.01 g)置于50 mL离心管中，加入20.0 mL乙腈，以350 r·min-1振荡提取30 min后，加入5 g氯化钠剧烈震荡1 min，再以9 500 r·min-1离心1 min，待净化。

1.2.2 净化

取2 mL上清液于10 mL离心管中，加入100 mg PSA和300 mg无水硫酸镁，漩涡1 min，9 500 r·min-1离心1 min。吸取净化上清液1.00 mL至另一试管中并加入1.00 mL 0.1%甲酸溶液混合均匀，过0.22 μm滤膜后供UPLC-MS/MS测定。

1.3 仪器条件

流动相为0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)，采用梯度淋洗(表1)，色谱柱柱温为35 ℃，进样体积10.0 μL。

离子源为电喷雾离子源，正离子扫描，采用多重反应监测模式(表2)，毛细管电压为2.50 kV，雾化气流速1 000 L·h-1，锥孔气流速50 L·h-1，离子源温度为150 ℃，雾化温度为500 ℃。

表1 流动相梯度洗脱条件

表2 多重反应监测

注：*为定量离子。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

首先对质谱条件进行优化。研究表明，嘧菌酯能在ESI+离子模式下产生丰富的离子碎片，并有较高的响应值。通过利用仪器自带的Intellistart软件，确定嘧菌酯的定性定量离子对及其对应的最优碰撞电压、锥孔电压等条件。此外，为进一步优化质谱条件，将嘧菌酯标准液在全扫描模式下分别优化毛细管电压、锥孔气流速、脱溶剂气流速等参数，最终确定嘧菌酯的质谱条件。同时，为有效分离目标物和杂质，提高嘧菌酯的灵敏度，还对液相条件进行了优化。结果表明，当流动相分别为乙腈-水、乙腈-乙酸铵溶液、乙腈-甲酸溶液时，乙腈-甲酸溶液体系下的嘧菌酯响应最高，这可能是由于甲酸提高了嘧菌酯的质子化效率[4]，进而提高了其灵敏度。与甲醇相比，选择乙腈为流动相时，相同梯度洗脱条件下出峰时间更快，能够缩短样品分析时间。因此，最终确定流动相为0.1%甲酸溶液-乙腈梯度洗脱，此条件下嘧菌酯响应高，峰型好，保留时间适中。

2.2 标准曲线

准确称取嘧菌酯标准品0.01 g于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，配制成质量浓度为100 mg·L-1的标准母液。将100 mg·L-1的嘧菌酯标准母液用定容溶剂(杨梅空白基质提取液∶0.1%甲酸溶液1∶1)稀释配制成10.0 mg·L-1作为基质标准母液，再用定容溶剂将其梯度稀释成0.50、0.10、0.050、0.010、0.005、0.001 mg·L-1不同浓度的标准基质工作液，按1.3节仪器条件进行测定。以进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线(图1)。结果表明，嘧菌酯在0.001～0.50 mg·L-1浓度线性关系良好，标准曲线方程为y=5 523 549x-15 069，相关系数r为0.999 8。

图1 杨梅基质中嘧菌酯标准曲线

2.3 方法的灵敏度、准确度和精密度

以3倍信噪比计算得出仪器的检出限为5.5×10-14g，灵敏度较高。为确定方法的准确度和精密度，取杨梅空白样品进行回收率试验，添加水平分别为0.005、0.1、1.0 mg·kg-1，每处理重复5次，按1.2节前处理步骤进行处理，基质匹配外标法定量。结果显示，嘧菌酯在杨梅中添加回收率为82%～105%，相对标准偏差为1.5%～10.2%。说明该方法准确度和精密度均较好，符合农药残留分析的要求[5]。

表3 嘧菌酯在杨梅中的添加回收率

3 小结与讨论

目前，关于嘧菌酯残留分析方法的研究报道相对较少，其分析方法主要集中在气相色谱检测[6-10]，且前处理较为复杂。如李瑞娟等[11]使用QuEChERS法进行前处理，采用气相色谱-电子捕获检测器对小麦中嘧菌酯残留量进行检测，其最小检出量为5×10-12g，最低检测浓度为0.01 mg·kg-1；曹俊丽等[12]利用气相色谱-质谱串联仪对稻田中的嘧菌酯进行了检测，方法检出限为0.01 mg·kg-1左右，定量限为0.05 mg·kg-1；范丽丽等[13]建立了铁皮石斛、浙贝母和人参中嘧菌酯的残留分析方法，采用乙腈提取、二氯甲烷液液萃取、柱层析净化、气相色谱-电子捕获检测器检测，方法的检出限为0.002～0.004 mg·kg-1，定量限为0.01 mg·kg-1。上述整个分析过程耗时相对较长，不利于大批量样品的分析测定和残留风险监控。本文所建立的方法基于QuEChERS法，并进行了简化，同时结合UPLC-MSMS检测，大大缩短了样品分析时间，且灵敏度、准确度亦均符合农药残留分析的要求。总之，本研究通过对仪器条件和前处理方法的优化，建立了杨梅中嘧菌酯残留的残留分析方法，可为有效监控杨梅中嘧菌酯的残留风险提供技术支撑。