刺老苞根皮醇提物对原代成骨细胞增殖、分化和矿化的影响*

李金诚，燕梦云，王松月，周文斌，裴凌鹏

(民族医药教育部重点实验室，中央民族大学，北京 100081)

骨质疏松症是一种因骨组织代谢异常引发的疾病，已成为严重威胁中老年人健康和生活质量的高发病，其病因主要是由于骨形成与骨吸收之间动态性失衡所导致。成骨细胞作为骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化，其增殖、分化缺陷是骨质疏松症发病的根本原因之一[1]。刺老苞根皮为五加科植物棘茎楤木(AraliaechinocaulisHand.-Mazz.)的根皮，药材呈块片状或槽状，气微香，嚼之带有黏液性。《滇南本草》曰：“刺脑包，又名刺老苞、鹊不宿。味苦辛、性凉。入脾、肾二经。治风湿疼、胃疼、跌打损伤。骨折，用鲜根捣碎，酒炒热敷。[2]”前期研究表明，刺老苞根皮总水提物可通过下调成骨细胞 Wnt/β-catenin信号通路中Axin蛋白表达，延长成骨细胞S期，促进其增殖、分化及矿化功能的作用[3-4]。为诠释刺老苞根皮不同提取方式中其他活性成分，本实验旨在通过观察刺老苞根皮醇提物对原代成骨细胞的增殖、分化和矿化的影响，为下一步分离纯化相关活性成分化合物提供可靠的实验依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂

细胞超净操作台(苏州苏洁净化设备有限公司)；CO2培养箱(Thermo Scientific 美国)；L535R-1低速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；MultiSkan酶标仪(Thermo Scientific 美国)；荧光倒置显微镜(Olympus 日本)；大孔吸附树脂(MCI)柱(三菱公司，日本)；刺老苞根皮(湖北恩施中药材有限公司，批号 0P 091101，经北京中医药大学生药系杨瑶珺教授鉴定)；α-MEM 培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶溶液(Gibco 美国)；青霉素/链霉素(P/S)、II型胶原酶、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、茜素红S染液、二甲基亚砜(Sigma 美国)；PBS(北京昌盛生物技术有限责任公司)；碱性磷酸酶染色试剂盒、碱性磷酸酶活性测定试剂盒(南京建成生物制品有限公司)。

1.2 动物

新生24 h SD大鼠乳鼠(雄性)10只，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证号SCXK-(军)2012-0004)。

2 方法

2.1 刺老苞根皮醇提物制备

取刺老苞根皮2 kg，经70%乙醇加热回流提取3次，2 h/次，旋转蒸发浓缩为400 mL浸膏；加入200 mL 10%乙醇溶液稀释；过MCI-GEL大孔吸附树脂柱，30%、50%乙醇梯度洗脱、分离；收集洗脱液，低温真空干燥成粉末，共获得4种不同刺老苞根皮醇提物30%(1-3)：5.23 g、30%～50%(3-4)：23.17 g、50%(1)：13.72 g、50%(2-3)：4.29 g。

2.2 原代成骨细胞培养

取雄性SD乳鼠10只，用75%乙醇浸洗后，在超净操作台内解剖取出颅盖骨，去除其他组织，PBS清洗，加入3 mL消化液(0.25%胰蛋白酶液:II型胶原酶溶液=2∶1)，37 ℃消化5 min弃上清液；加入3 mL 消化液，37 ℃消化10 min，收集上清液，加9 mL完全培养基(89%α-MEM、10% FBS、1% P/S)中和消化，重复消化4次，收集液体离心吸去上清液，加完全培养基重悬细胞，调整密度接种于25 cm2培养瓶，37 ℃、5% CO2培养。

2.3 成骨细胞鉴定

取第3代前成骨细胞，以1×105cells/mL接种于24孔培养板，1 mL/孔；培养48 h后加分化培养基(含10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL 抗坏血酸)诱导，每2 d换液1次，培养4 d和14 d，分别进行ALP染色和矿化结节染色鉴定。

2.4 成骨细胞毒性分析

取第4代前成骨细胞，以2.5×104cells/mL接种于96孔培养板，0.2 mL/孔；培养48 h后加含药培养基干预培养；实验分组为不含药物的对照组和刺老苞根皮醇提物处理组，另设调零孔，每组3个复孔；48 h后吸去培养液，PBS清洗细胞2次，按MTT细胞增殖及细胞毒性检测测试盒说明检测，即加0.09 mL新鲜培养液和0.01 mL MTT溶液，继续培养4 h取出吸去上清，加0.11 mL Formazan溶解液，低速振荡10 min，酶联免疫检测仪测定其490 nm处各孔吸光值(A)。

2.5 ALP活性测定

取第4代前成骨细胞，以1×105cells/mL接种于24孔培养板，1 mL/孔；培养48 h后，加含药(1、10、100 μg/mL)分化培养基(含10% FBS、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μg/mL抗坏血酸)干预，每2 d换液1次，4 d后吸取培养液离心，收集上清液按碱性磷酸酶测试盒说明测定。

2.6 成骨细胞钙化结节染色

取第4代前成骨细胞，以1×105cells/mL接种于24孔培养板，1 mL/孔；培养48 h后加含药(1、10、100 μg/mL)分化培养基(含10% FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μg/mL 抗坏血酸)干预，每2 d换液1次，14 d后吸去培养液，各孔用PBS清洗3次；加10%中性福尔马林，2 mL/孔，固定15 min，蒸馏水冲洗3次，按茜素红S染色试剂说明操作。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 原代成骨细胞鉴定

图1～3显示，第3代前成骨细胞培养24 h后，可见不规则伸展状贴壁细胞，48 h后细胞呈三角形、长梭形等形态，细胞核清晰可见。分化诱导培养4 d后经ALP染色，荧光倒置显微镜下可见灰黑色颗粒或块状、条状沉淀；分化诱导培养14 d后，经茜素红染色，荧光倒置显微镜下可见橙红色钙沉积物。

3.2 刺老苞根皮醇提物对前成骨细胞活性的影响

表1显示，与对照组比较，刺老苞根皮醇提物30%(1～3)、50%(1)、50%(2`3)不同浓度组(100、200、400、800 μg/mL)干预前成骨细胞48 h后，各浓度组细胞生存率增高，均能明显促进前成骨细胞的增殖；刺老苞根皮醇提物30%～50%(3～4)100 μg/mL浓度组细胞生存率增高，200、400、800 μg/mL浓度组细胞生存率下降，差异有统计学意义(P<0.01)。4种刺老苞根皮醇提物浓度在0～100 μg/mL，可排除刺老苞根皮醇提物促进前成骨细胞生长的假阳性结果。

3.3 刺老苞根皮醇提物对成骨细胞ALP活性的影响

表2显示，与对照组比较，4种刺老苞根皮醇提物各浓度组干预成骨细胞4 d后，刺老苞根皮醇提物30%(1～3)、50%(1)、50%(2～3)低浓度组(1 μg/mL)细胞ALP活性明显提高，促进成骨细胞分化；中、高浓度组(10、100 μg/mL)细胞ALP活性下降，对成骨细胞分化呈抑制作用。

图1 成骨形态

图2 ALP染色

图3 矿化染色

组 别例数Cell Viability(%)30%(1～3)30%～50%(3～4)50%(1)50%(2～3)Control3100100100100100 μg/mL3111.82±10.06129.21±14.62**132.60±7.74**203.28±9.85**200 μg/mL3122.66±4.1165.31±7.00**113.57±0.66166.30±4.66**400 μg/mL3112.32±13.4845.84±2.88**94.31±11.82184.03±3.96**800 μg/mL3134.25±25.15*52.33±12.35**137.20±20.21**172.87±6.21**

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

表2 4种刺老苞根皮醇提物对成骨细胞ALP活性的影响

注：与对照组比较：*P<0.05

3.4 刺老苞根皮醇提物对成骨细胞钙结节形成的影响

表3显示，与对照组比较，4种刺老苞根皮醇提物各浓度组干预成骨细胞14 d后，钙化结节面积占比增加，形状多为圆形和椭圆形，少数为不规则形状，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表3 4种刺老苞根皮醇提物对成骨细胞钙化结节形成的影响

注：与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

成骨细胞是由间充质祖细胞(即软骨祖细胞)分化产生，是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化，其胞浆膜上分泌的ALP (同型二聚体糖蛋白)是成骨细胞早期分化的指标。ALP调节骨基质的成熟稳定，是矿化的先决条件，而矿化是成骨细胞分化的最后阶段，也是成骨细胞体外成骨的早期标志。当成骨细胞数量不足或活性功能低下时，将打破骨形成与骨吸收之间的动态平衡，加速骨质疏松症的形成[5-7]。

刺老苞根皮作为土家族临床常用药，对骨损伤具有很好的疗效。临床数据表明，刺老苞根皮具有修复骨损伤的功能。如乌日图等[8]发现，刺老苞根皮能减轻膝关节骨性关节炎患者局部症状，恢复关节功能。前期研究发现，刺老苞根皮含有较高的总皂苷、总黄酮和多糖，其总水提物有促进骨形成、提高骨矿物质水平与骨密度值的作用，其黄酮类成分对绝经后所致骨质疏松引起的骨折具有一定的防治作用[9-10]，但关于刺老苞根皮皂苷成分及其药效学研究尚未有突破性进展。本实验采取70%乙醇回流，10%乙醇稀释过柱，30%、50%乙醇梯度洗脱，获得4种主要成分为皂苷的刺老苞根皮醇提取物，并用于原代成骨细胞干预研究，分析不同浓度乙醇提取的皂苷成分对原代成骨细胞增殖、分化和矿化的影响，而对于破骨细胞方面的研究则另文报道。本实验结果表明，原代成骨细胞经刺老苞根皮醇提物不同浓度组干预后，细胞生存率明显高于对照组，低浓度组ALP活性升高，矿化结节面积增加。分析原因可能为低浓度的刺老苞根皮醇提物可以通过促进成骨细胞增殖，增加对ALP的需求量，致使ALP活性提高，促进成骨细胞分化，提高骨基质矿化的作用效率，促进骨形成。

综上所述，4种刺老苞根皮醇提物可促进原代成骨细胞增殖、分化和矿化，其研究结果可以为全面评价刺老苞根皮临床防治骨质疏松症的药效作用提供实验参考依据，但因刺老苞根皮皂苷成分研究起步较晚，目前研究内容主要围绕药物物质基础方面开展，其药效药理机制尚不明确，仍需进一步探讨。