超高效液相色谱-串联质谱测定草莓中醚菌酯残留量

李国烈，覃明丽，苏 旭，杜 鑫，蒋金芳，何沛蓉，何家国

(南充农产品质量监测检验中心，四川 南充 637000)

醚菌酯化学名称为(E)-2-甲氧亚氨基-[2-(邻甲基苯氧基甲基)苯基]乙酸甲酯，属于甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有高效、广谱、低毒等特点，其作用机理在于阻断真菌产生ATP，使真菌停止生长或受到抑制。醚菌酯主要用于防治卵菌纲、藻菌纲、子囊菌纲、半知菌纲的真菌病害，现已被广泛用于防治草莓白粉病和黄瓜白粉病等病害[2-6]。目前国内外醚菌酯残留分析方法主要包括液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法等、气相色谱法[9-12]和气相色谱-质谱联用法[13-14]。醚菌酯在草莓中的残留检测方面，李辉等[15]报道了采用气相色谱法测定醚菌酯在草莓中的残留，他们使用丙酮提取，二氯甲烷萃取，弗罗里硅土层析柱净化，气相色谱仪石英毛细管柱分析，外标法定量。最终得出在0.006和1.000mg/kg添加水平下(5个平行)，平均回收率分别为88.19%和92.02%，回收率相对标准偏差分别为7.76%和7.47%。赵尔成等[16]报道了采用气相色谱-质谱仪测定草莓中醚菌酯的残留，他们采用乙腈提取，PSA和无水硫酸镁净化，气相色谱-质谱仪DB-5 MS色谱柱分析。最终指出该方法的检出限为0.05mg/kg，并且在0.05和0.5mg/kg添加水平下(5个平行)，醚菌酯的回收率在85.3%～104.5%，平均为97%和92%，相对标准偏差分别为6.8%和7.3%。到目前为止，尚未见报道采用超高效液相色谱-串联质谱测定醚菌酯在草莓中的残留。本试验建立了草莓中醚菌酯残留检测的超高效液相色谱-串联质谱方法(UPLC-MS/MS)，以期为进行风险评估和监测食品安全提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品和试剂 醚菌酯标准品购于农业部环境保护科研监测所(编号：SB-212-2008)，甲醇、乙腈，甲苯，甲酸均为色谱级，购自Fisher公司。

1.2 仪器和设备 超高效液相色谱-质谱仪(Waters，UPLC-TQS)，色谱柱(Waters，Xbridge C18，3.5μm 3.0×50mm)，超纯水仪(Millipore，Milli-Q)，旋涡混合器(IKA，Vortex Genius 3)，匀浆机(IKA，T25)，旋转蒸发仪(上海亚荣，RE-2000A)，固相萃取小柱(Agilent，CARB/NH2500mg/6mL)，固相萃取装置(Agilent)以及微孔滤膜(津腾，PTFE 0.22μm)等。

1.3 样品前处理 准确称取匀浆后的草莓样品25.00g于250mL三角瓶中，加入50.00mL乙腈，用匀浆机高速匀浆2min后用滤纸过滤，滤液收集到装有10g氯化钠的100mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1min，在室温下静置30min，移取出上清液10.00mL待净化。

1.4 样品净化 将移取的10.00mL提取液加入已经过5 mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)预淋洗ProElut CARB/NH2柱(500mg/6mL)，收集淋洗液，再用25mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)分5次洗脱，合并淋洗液，于40℃水浴锅蒸发近干，用5.00mL 70%甲醇定容，过0.22μm滤膜，待检测。

1.5 超高效液相色谱-质谱条件 流动相采用甲醇，乙腈和含有0.1%甲酸水溶液进行梯度洗脱，洗脱程序(表1)，流动相使用前用超声波脱气。柱温：40℃，进样量：3.0μL。质谱采用电喷雾离子源正离子模式(ESI+)，多反应监测(MRM)方式进行采集，相关参数(表2)。

表1 流动相及梯度洗脱条件

表2 测定醚菌酯在草莓中残留的质谱参数

1.6 标准曲线和检测限 分别取一定量的醚菌酯标品溶液用草莓空白基质配制成浓度为0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00和50.00μg/L的标准液，采用1.5仪器条件进行分析，以醚菌酯定量离子的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作标准曲线，并进行回归分析求出回归方程和相关系数。标准曲线采用Masslynx V4.1软件绘制。检测限采用在最低浓度附近添加一系列已知浓度的双份样品进行测定，采用Masslynx V4.1软件计算醚菌酯的信噪比(S/N)，以S/N≥3时的样品浓度为方法检测限[17]。

1.7 加标回收和精密度 取草莓空白样品，根据高、中、低3个浓度分别加入相应的醚菌酯标准溶液，每个浓度水平做6个平行质控样品。所有样品按1.3和1.4进行样品前处理，采用1.5仪器条件测定药物浓度，计算方法的加标回收。精密度试验采用加入法。取草莓空白样品，根据高、中、低3个浓度分别加入相应的醚菌酯标准溶液，每个浓度水平做6个平行。所有样品按1.3和1.4进行样品前处理，采用1.5仪器条件测定药物浓度，连续测定3d，根据随行测定的标准曲线计算样品的实测浓度，即可求得方法的日内和日间精密度。

1.8 基质效应、提取回收率和方法过程效率 采用Matuszew ski等[18]提出的方法，比较不同条件下的峰面积平均值。在纯的醚菌酯标品溶液(A)，草莓样品基质提取后添加醚菌酯标品(B)和草莓样品基质提取前添加醚菌酯标品(C)3个条件下，分别采用高、中、低3个浓度来评价醚菌酯在草莓样品中的基质效应、提取回收率和过程效率，每个条件下重复测定6个样品。基质效应=B/A，提取回收率=C/B，方法过程效率=C/A。

2 结果与分析

2.1 方法选择性 该试验条件下，醚菌酯采用反相液相色谱分离，流动相中加入0.1%体积分数的甲酸来提高ESI+的离子化效率。结果表明，醚菌酯保留时间适中(5.25min)，峰形及分离度良好，且可获得较强的分子离子峰强度，草莓基质对草莓样品中醚菌酯的测定无干扰。醚菌酯标准溶液图谱、草莓空白样品图谱、醚菌酯草莓基质匹配标液和草莓样品加标图谱(图1、图2、图3和图4)。

图1 醚菌酯标准溶液图谱(0.50μg/L)图2 草莓空白样品图谱图3 醚菌酯草莓基质标液图谱(0.50μg/L)图4 草莓加标样品图谱(0.50μg/L)

2.2 标准曲线和检测限 醚菌酯标准曲线在质量浓度0.50～50.00μg/L时线性关系良好，标准曲线回归方程为y=4.284 17×106x+228.13(R2=0.998)。以3倍基线噪音的药物浓度为最低检测限，醚菌酯在草莓中的方法检出限(method detection limit，MDL)为0.10μg/kg。以4倍MDL为测定下限，即4倍方法检出限浓度作为测定下限，则醚菌酯在草莓中的测定下限为0.50μg/kg[17]。

2.3 加标回收和精密度 醚菌酯在0.50、5.00和50.00μg/kg 3个浓度的草莓添加样品回收率

分别为95.4%、94.3%和92.2%，日内精密度相对标准偏差分别为3.75%、3.36%和2.57%，日间精密度相对标准偏差分别为5.34%、4.24%和5.04%，(表3和表4)。表明该试验方法在测定草莓中醚菌酯的残留时具有较好的准确度。

表3 草莓中醚菌酯加标回收(n=6)

表4 草莓中醚菌酯日内精密度和日间精密度(n=6)

2.4 基质效应、提取回收率和方法过程效率 该试验条件下，采用提取后加入法从3个浓度水平来评价醚菌酯在草莓样品中的基质效应、提取回收率和过程效率，其结果(表5)。在0.50、5.00和50.00μg/L 3个浓度水平下，醚菌酯在草莓样品中的基质效应分别为(96.08±5.01)%、(93.21±1.67)%和(93.31±0.74)%，表现为基质抑制效应，并且基质效应影响较小；提取回收率分别为(95.41±3.51)%、(94.37±4.14)%和(92.19±2.11)%，相应的相对标准偏差分别为3.69%，4.39%和2.29%，均满足农药残留试验准则的要求[19]；方法过程效率分别为(91.64±5.19)%、(87.92±2.96)%和(86.02±1.86)%，表明该试验方法方法过程效率较好。

表5 3个不同浓度下的信号峰面积及基质效应、回收率和过程效率的计算结果(n=6)

3 讨论

该试验样品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基复合柱净化，超高效液相色谱-质谱法(UPLC-MS/MS)检测醚菌酯在草莓中的残留，该方法前处理过程操作简便，方法的选择性好。检测限和定量限均低于GB 2763-2016中规定醚菌酯在草莓中的最大限量值(2 mg/kg)[20]，回收率、精密度和提取回收率均满足农药残留试验准则的要求。另外，通过基质效应的结果可以得出该试验方法基质效应对结果没有显著的影响，因此，该试验方法也可以不采用空白基质配制标准溶液，以简化试验过程。