均匀设计优化白参菌多糖硫酸酯化修饰条件

董 昊，包彦强，韩鹏虎，蒋志悦，韩丽琴

(吉林医药学院药学院,吉林 吉林 132013)

多糖是生物体内除蛋白质和核酸外的一类大分子物质，具有抗氧化、抗衰老、调节机体免疫、抗癌等作用[1-2]。化学基团的引入可以明显改善多糖的溶解度[3]，常常会增强多糖的活性或使多糖产生新的活性[4-5]。硫酸酯化多糖是指多糖中的羟基被硫酸基所取代，从而发生结构的改变，具有更强的抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血等作用[6]。白参菌，又名裂褶菌、白花，是一种食药兼用的珍稀菇菌。白参菌富含锌、铁、钾、钙、磷、硒、锗，而且有较高的药用价值，能防治神经衰弱、清肝明目、健胃、润肺、抗癌、抗炎症[7]。白参菌多糖是白参菌发挥作用的主要有效成分之一。白参菌多糖能显著抑制肿瘤生长，使化疗后引起的白细胞下降得到较快回升;可恢复老年动物细胞免疫及体液免疫的功能，对延缓衰老也可能有一定意义[8-9]。本研究采用均匀实验分析方法，从而得到白参菌多糖硫酸酯化的最佳修饰条件，为进一步研究其功能与生理活性打下基础。

1 材料与方法

1.1 研究材料

白参菌多糖(自制)，无水乙醇，硫酸，氨基磺酸，二甲基亚砜，乙二胺四乙酸二钠，其余试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

仪器JB-3定时恒温磁力搅拌器；FA1104N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；800电动离心机；T6新世纪紫外可见分光光度计；Verterx70型傅里叶变换红外光谱仪。

1.2 多糖的修饰

取一定量纯化的白参菌多糖于三颈烧瓶中，加入甲酰胺，搅拌使其完全溶解，加入适量的氨基磺酸，在一定温度下进行反应，然后用10%NaOH调pH至7.0～8.0，加入3倍量的95%乙醇醇沉24 h，离心，收集沉淀，沉淀复溶，用3500的透析袋透析72 h，再对透析液进行浓缩，冷冻干燥，即得硫酸酯化修饰后的白参菌多糖[10]。多糖修饰后取代度测定标准曲线的绘制[10]。

1.3 多糖修饰后取代度测定标准曲线的绘制

准确吸取1 g/L的标准硫酸钠溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.18、0.20 mL,于具塞试管中，以1 mol/L的盐酸溶液补至0.20 mL,用0.20 mL的盐酸溶液作为空白，分别加入三氯乙酸3.8 mL及氯化钡-明胶溶液1.0 mL，摇匀静置15 min(室温)。于360 nm波长处，测得吸光度A1，再以1.0 mL的明胶溶液代替氯化钡-明胶溶液，测吸光度A2，以硫酸基浓度为横坐标，以吸光度(A1-A2)为纵坐标绘图[11]。

1.4 样品取代度的测定

准确称取10 mL修饰后的多糖，加入到50 mL容量瓶中，加入1 mol/L盐酸溶液，于100 ℃下反应3 h后终止反应。用1 mol/L盐酸溶液定容至50 mL，摇匀，离心取上清液，测定硫酸根的含量。白参菌多糖的硫酸根取代度的计算公式为[12]:

DS=1.62S/(32-1.02S)

1.5 均匀实验设计

本实验采用均匀设计实验U10(53)来安排实验，考察温度、时间、投料比(氨基磺酸质量/多糖质量)5个因素对硫酸基取代度的影响，每个因素取5个水平，优化白参菌多糖硫酸酯化具体条件见表1[13]。

表 1 因素水平设计

2 结果与分析

2.1 修饰前后多糖红外光谱图的比较

白参菌多糖修饰前后的红外光谱如图1、2所示，多糖在3200～3500 cm-1的宽峰是O-H伸缩振动；2900 cm-1左右的吸收峰为糖类C-H伸缩振动；1000～1200 cm-1的吸收峰是由两种C-O伸缩振动所引起的；糖环形态为吡喃糖环[14-15]。修饰后的白参菌多糖，其中3200～3500 cm-1的吸收峰为多糖中-OH的吸收峰的变窄，说明羟基数量有所减少。在1700 cm-1附近有一明显的吸收峰,该峰-OSO3的S=O伸缩振动吸收峰,这表明硫酸中的硫酸基已被转移到了白参菌多糖中，形成了新的化学键。

图 1 白参菌多糖的红外光谱图

图 2 硫酸酯化白参菌红外光谱图

2.2 均匀实验结果及分析

白参菌多糖修饰均匀实验结果见表2,数据处理结果见表3。

表2数据采用均匀设计实验处理软件DPS8.0进行二次多项式逐步回归分析[16]得到拟合方程：

Y=-25.193 5-0.624 5×X1+8.788 1×X2+

0.124 2×X1×X2-0.066 7×X1×X3

式中Y为硫酸根取代度，X1为反应温度，X2为反应时间，X3为投料比。

拟合方程的P=0.002，方程有显著意义；剩余标准残差SSE=0.009 4，调整后的相关系数R为0.998 7。从表3可以看出时间和投料比与硫酸根的取代度成正相关，而温度则成负相关。因此，在实验中可以增加反应时间，增大投料比，降低反应温度，以使硫酸根的取代度达到最大。

根据回归方程，得到的最优组合为反应温度50.2 ℃，反应时间2.18 h，投料比为2.15∶1。

表 2 均匀实验设计结果

表 3 二次多项式逐步回归数据处理结果

2.3 验证性试验

在反应温度50.2 ℃、反应时间2.18 h、投料比为2.15∶1的条件下，称取干燥至恒重的白参菌多糖3份各2.0 g，平行进行3次酯化操作，得到3份硫酸酯化的白参菌多糖，其取代度分别为0.453、0.460、0.458，与均匀设计结果的差异不显著。验证实验说明均匀实验设计方法筛选的白参菌多糖硫酸酯化工艺可靠、稳定。

3 讨 论

采用均匀设计实验分析方法优化实验条件，能通过较少的实验次数囊括较多的实验因素，利用软件进行回归分析，提高了分析结果的准确度，确定了最佳修饰条件，验证实验更加表明均匀实验能较好地拟合反应体系。

采用氨基磺酸法进行白参菌多糖的硫酸酯化修饰，相比于其他实验方法毒性更小，而且反应条件温和，便于控制反应过程，取得与其他方法相似的取代度[15,17]，说明该方法的实用性较好，可行性较高。